基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的黃唇魚(yú)SSR分子標(biāo)記篩選

趙彥花 區(qū)又君 溫久福 李加兒 周慧

摘要：【目的】篩選出可用于黃唇魚(yú)（Bahaba flavolabiata）遺傳資源評(píng)價(jià)及親緣鑒定的SSR分子標(biāo)記，為開(kāi)展其保護(hù)遺傳學(xué)研究打下基礎(chǔ)。【方法】利用Illumina HiSeq 4000測(cè)序平臺(tái)對(duì)野生黃唇魚(yú)樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，采用TGICL對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類(lèi)去冗余以獲得Unigene，并通過(guò)生物信息學(xué)方法進(jìn)行功能注釋分類(lèi)、代謝通路和SSR特征分析等。【結(jié)果】黃唇魚(yú)混合組織的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序共獲得13.43 Gb數(shù)據(jù)，經(jīng)組裝并去冗余后獲得65047條Unigenes。采用BLAST對(duì)組裝獲得的Unigenes進(jìn)行七大功能數(shù)據(jù)庫(kù)（NR、NT、GO、COG、KEGG、Swissprot和Interpro）注釋，結(jié)果共有55583條Unigenes被注釋（占85.45%）。通過(guò)MISA對(duì)黃唇魚(yú)的Unigene進(jìn)行SSR搜索，共檢測(cè)到29797個(gè)SSR位點(diǎn)分布于19664條Unigenes中。SSR位點(diǎn)分布類(lèi)型及其特征分析結(jié)果顯示，最主要的重復(fù)類(lèi)型為二核苷酸重復(fù)基元（11855個(gè)，占39.79%），其次是單核苷酸重復(fù)基元（9695個(gè)，占32.54%）和三核苷酸重復(fù)基元（6663個(gè)，22.36%），而四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復(fù)基元的數(shù)量相對(duì)較少。二核苷酸重復(fù)基元類(lèi)型中重復(fù)最多的基序是AC/GT（8355條），在三核苷酸重復(fù)基元類(lèi)型中重復(fù)最多的基序是AGG/CCT（1866條）。從隨機(jī)選取的186對(duì)SSR引物中，最終篩選出47對(duì)擴(kuò)增穩(wěn)定性好且具有多態(tài)性的SSR引物，以二核苷酸和四核苷酸重復(fù)基元的擴(kuò)增結(jié)果居多。【結(jié)論】通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序能有效篩選出具有多樣性的黃唇魚(yú)SSR分子標(biāo)記，可為黃唇魚(yú)的遺傳多樣性分析、親緣鑒定和遺傳圖譜構(gòu)建等后續(xù)研究提供基礎(chǔ)資料。

關(guān)鍵詞： 黃唇魚(yú);SSR分子標(biāo)記;轉(zhuǎn)錄組測(cè)序;功能注釋;多態(tài)性

中圖分類(lèi)號(hào)： S965.299? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2019）09-2078-10

Abstract：【Objective】SSR markers， which could be used to evaluate genetic resources and identify genetic relatives of Bahaba flavolabiata， were selected to lay a foundation for the study of conservation genetics. 【Method】Illumina HiSeq 4000 sequencing platform was used to carry out transcriptome sequencing on wild B. flavolabiata. TGICL was used to cluster and remove redundancy from transcriptome data to obtain Unigene. Functional annotation classification， metabolic pathway and SSR characteristics were analyzed by bioinformatics. 【Result】Transcriptome sequencing of mixed tissues of B. flavolabiata obtained a total of 13.43 Gb data， and 65047 Unigenes were obtained after assembly and redundancy removal. Unigenes generated by BLAST were annotated in seven functional databases（NR， NT， GO， COG， KEGG， Swissprot and Interpro）， and a total of 55583 Unigenes were annotated（accounting for 85.45%）. Through SSR search on Unigenes of B. flavolabiata by MISA， a total of 29797 SSRs were detected distributed in 19664 Unigenes. SSR loci distribution type and its characteristic analysis results showed that， the major repeat types were dinucleotide repeat units （11855， accounting for 39.79%）， followed by single nucleotide repeat units（9695， accounting for 32.54%） and trinucleo-tide repeat units（6663， accounting for 22.36%）， while the number of tetrapotide， pentapotide and hexapotide repeat units was relatively small. The most repeated motif in dinucleotide repeats was AC/GT（8355）， while the most repeated motif in dinucleotide repeats was AGG/CCT（1866）. From the 186 pairs of SSR primers randomly selected， 47 pairs of SSR pri-mers with good amplification stability and polymorphism were finally selected， and the amplification results of dinucleotide and tetrauleotide repeat primitives were the majority. 【Conclusion】SSR molecular markers with diversity can be effectively screened out by transcriptome sequencing， which can provide basic data for the genetic diversity analysis， genetic identification and genetic mapping construction of B. flavolabiata.

Key words： Bahaba flavolabiata; SSR makers; transcriptome sequencing; functional annotation; polymorphism

0 引言

【研究意義】微衛(wèi)星（Microsatellite）廣泛分布于真核生物基因組中，是由1～6個(gè)核苷酸單位組成的簡(jiǎn)單串聯(lián)重復(fù)序列，因此又稱為簡(jiǎn)單序列重復(fù)（Simple sequence repeats，SSR）。SSR廣泛分布于基因組的不同位置，其高度多態(tài)性主要來(lái)源于串聯(lián)數(shù)目的不同（熊良偉等，2018）。SSR分子標(biāo)記具有分布數(shù)量豐富、多態(tài)性高、共顯遺傳、擴(kuò)增穩(wěn)定和易檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)（王忠華等，2008），在種質(zhì)遺傳多樣性分析、親緣關(guān)系鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建及分子標(biāo)記輔助育種等領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用（趙志英等，2018），且逐漸發(fā)展成為經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)遺傳結(jié)構(gòu)分析、親緣關(guān)系鑒定及遺傳圖譜構(gòu)建等方面的有效工具（孫效文等，2008;謝子強(qiáng)等，2013;何福玲等，2017），但SSR分子標(biāo)記具有種質(zhì)特異性，因此使用前必須提前進(jìn)行篩選開(kāi)發(fā)。【前人研究進(jìn)展】目前，開(kāi)發(fā)SSR分子標(biāo)記最常用的方法主要有：①?gòu)墓矓?shù)據(jù)庫(kù)中查找SSR位點(diǎn);②近緣物種間引物轉(zhuǎn)移擴(kuò)增;③從基因組DNA中篩選SSR位點(diǎn)（王玲玲等，2017）。第①種方法經(jīng)濟(jì)方便，但局限于已開(kāi)發(fā)出SSR位點(diǎn)的物種，且引物數(shù)量不會(huì)增加。第②種方法在不同物種間共用SSR引物時(shí)，其盲目性較大，具有一定的風(fēng)險(xiǎn)性和局限性。對(duì)于無(wú)法從前兩種方法獲得SSR引物的物種，可從基因組DNA中篩選SSR位點(diǎn)，但需經(jīng)建庫(kù)、雜交、分離及測(cè)序等步驟，工作量大、效率低。采用傳統(tǒng)磁珠富集法開(kāi)發(fā)SSR分子標(biāo)記效率低且成本高（Zane et al.，2002），而利用高通量測(cè)序技術(shù)開(kāi)發(fā)SSR分子標(biāo)記能極大提高開(kāi)發(fā)效率，并有效降低成本。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)可快速獲得生物體內(nèi)較全面的轉(zhuǎn)錄本信息，尤其對(duì)于缺乏基因組信息的魚(yú)類(lèi)，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)是獲得大量分子標(biāo)記的有效手段（王明等，2015）。近年來(lái)，隨著轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)測(cè)定轉(zhuǎn)錄組cDNA序列揭示特定細(xì)胞或組織中表達(dá)的全部基因已在許多物種上得到廣泛應(yīng)用，并開(kāi)發(fā)出大量基于轉(zhuǎn)錄組的分子標(biāo)記，如夏威夷石斑魚(yú)（Epinephelusquernus）（Rivera et al.，2003）、金槍魚(yú)（Thunnus thunnus）（Clark et al.，2004）、紅鰭東方鲀（Fugu rubripes）（Furukawa et al.，2004）、大西洋鮭 （Salmo salar）（King et al.，2005）、大菱鲆（Scophthalmus maximus）（Pardo et al.，2005）、羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）（孫成飛等，2015）、二長(zhǎng)棘鯛（Parargyrops edita）（楊兵等，2015）和黃姑魚(yú)（Nibea albiflora）（龔詩(shī)琦等，2016）等。【本研究切入點(diǎn)】黃唇魚(yú)（Bahaba flavolabiata）是我國(guó)特有種，俗稱金錢(qián)鮸、金錢(qián)鳘、大鷗和白花等，隸屬于硬骨魚(yú)綱鱸形目石首魚(yú)科黃唇魚(yú)屬（區(qū)又君等，2010，2011，2012，2013，2014），一直被視為上等補(bǔ)品，尤其是其鰾（俗稱魚(yú)膠）甚為珍貴，具有滋補(bǔ)肝腎之功效。由于生態(tài)環(huán)境惡化和過(guò)度捕撈等原因，導(dǎo)致黃唇魚(yú)自然資源急劇下降，于1988年被列為國(guó)家二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物，2006年被世界自然保護(hù)聯(lián)盟（IUCN）紅色名錄列為極度瀕危物種，因而制約了黃唇魚(yú)生物學(xué)研究的開(kāi)展。目前，基于SSR分子標(biāo)記的黃唇魚(yú)遺傳多樣性分析鮮見(jiàn)報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】利用Illumina HiSeq 4000測(cè)序平臺(tái)對(duì)野生黃唇魚(yú)樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，采用TGICL對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類(lèi)去冗余以獲得Unigene，并通過(guò)生物信息學(xué)方法進(jìn)行功能注釋分類(lèi)、代謝通路和SSR特征分析等，旨在篩選出可用于黃唇魚(yú)遺傳資源評(píng)價(jià)及親緣鑒定的SSR分子標(biāo)記，為開(kāi)展其保護(hù)遺傳學(xué)研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序樣本為珠江口海域誤捕的黃唇魚(yú)，共1尾。用于多態(tài)性引物篩選的樣本來(lái)自同一海域的野生黃唇魚(yú)，共6尾，剪取其鰭條后酒精保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2 黃唇魚(yú)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

委托深圳華大基因科技有限公司進(jìn)行黃唇魚(yú)各組織總RNA提取，采用Illumina HiSeq 4000進(jìn)行測(cè)序，獲得黃唇魚(yú)轉(zhuǎn)錄組的原始序列。原始序列經(jīng)數(shù)據(jù)過(guò)濾后得到高質(zhì)量的Clean reads，以Trinity對(duì)Clean reads進(jìn)行組裝，然后采用TGICL對(duì)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行聚類(lèi)去冗余以獲得Unigene。利用MISA對(duì)Unigene的SSR位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，單核苷酸重復(fù)大于12次、二核苷酸重復(fù)大于6次、三核苷酸和四核苷酸重復(fù)大于5次、五核苷酸和六核苷酸重復(fù)次數(shù)大于4次的判斷為SSR位點(diǎn)。

1. 3 基因組DNA提取與檢測(cè)

取6尾黃唇魚(yú)樣本尾鰭各30.0 mg左右，使用海洋動(dòng)物組織基因組DNA試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取基因組DNA。取6.0 μL左右的DNA樣品進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用NanoDrop ND-1000紫外分光光度儀檢測(cè)其濃度和質(zhì)量;獲得的DNA用雙蒸水稀釋成100 ng/μL工作液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 4 SSR引物設(shè)計(jì)與驗(yàn)證

1. 4. 1 SSR引物設(shè)計(jì) 使用Primer Premier 3.0對(duì)含SSR位點(diǎn)的Unigenes進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，共設(shè)計(jì)出26949對(duì)引物。引物設(shè)計(jì)原則：GC含量為40%～60%，引物長(zhǎng)度為18～23 bp，退火溫度為55～65 ℃，目的片段長(zhǎng)度為80～200 bp。從上述引物中隨機(jī)選取186對(duì)引物，委托廣州擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行引物合成，篩選條件：二核苷酸重復(fù)基元在8次以上，三核苷酸和四核苷酸重復(fù)基元在5次以上，五核苷酸和六核苷酸重復(fù)基元在4次以上。

1. 4. 2 PCR擴(kuò)增 在Eppendorf普通梯度PCR儀中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系10.0 μL，包括100 ng/μL基因組DNA 1.0 μL，2×PCR Mix 5.0 μL，正、反向引物各0.4 μL，超純水3.2 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃ 30 s，55～65 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。最終確定各引物最適退火溫度為58 ℃，PCR產(chǎn)物以3%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，篩選出121對(duì)可擴(kuò)增出目的片段的SSR引物。

1. 4. 3 SSR引物多態(tài)性檢測(cè) 將121對(duì)SSR引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物送至廣州擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序和多態(tài)性檢測(cè)。測(cè)序采用ABI 3730XL儀器檢測(cè)得到測(cè)序峰圖，然后以Chromas查看峰圖，找到出現(xiàn)多態(tài)性的引物擴(kuò)增結(jié)果，確定具有多態(tài)性的引物。多態(tài)性測(cè)序結(jié)果的判斷方法：查看峰圖找到重復(fù)序列位置，確認(rèn)出現(xiàn)套峰的位置是否位于重復(fù)序列區(qū)間。另外，結(jié)合兩個(gè)終止峰（A堿基）位置判斷重復(fù)數(shù)的差異數(shù)量，從而確定引物的擴(kuò)增結(jié)果是否存在多態(tài)性。

2 結(jié)果與分析

2. 1 黃唇魚(yú)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果

黃唇魚(yú)混合組織的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序共獲得13.43 Gb數(shù)據(jù)，經(jīng)組裝并去冗余后獲得65047條Unigenes，其總長(zhǎng)度為69382127 bp、平均長(zhǎng)度為1066 bp，N50（按Unigene長(zhǎng)度從大到小排序后逐個(gè)累加至所有Unigenes總長(zhǎng)度的50%時(shí)，最后一個(gè)累加的數(shù)值即為N50，用于衡量組裝的連續(xù)性，數(shù)值越大說(shuō)明組裝效果越好）為2032 bp，GC含量為46.65%。Unigene長(zhǎng)度分布情況如圖1所示，其中，最小片段長(zhǎng)度為300 bp，數(shù)量最多，有17704條;片段長(zhǎng)度大于3000 bp的Unigenes有5013條。

2. 2 Unigene功能注釋結(jié)果

采用BLAST對(duì)組裝獲得的Unigenes進(jìn)行七大功能數(shù)據(jù)庫(kù)（NR、NT、GO、COG、KEGG、Swissprot和Interpro）注釋，注釋結(jié)果詳見(jiàn)表1。其中，38086條Unigenes注釋到NR數(shù)據(jù)庫(kù)（58.55%），54929條Unigenes注釋到NT數(shù)據(jù)庫(kù)（84.45%），32384條Unigenes注釋到Swissprot數(shù)據(jù)庫(kù)（49.79%），12572條Unigenes注釋到COG數(shù)據(jù)庫(kù)（19.33%），31228條Unigenes注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)（48.01%），3099條Unigenes注釋到GO數(shù)據(jù)庫(kù)（4.76%），28318條Unigenes注釋到Interpro數(shù)據(jù)庫(kù)（43.53%）。NR數(shù)據(jù)庫(kù)屬于非冗余蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)，其數(shù)據(jù)來(lái)源于GenPept、Swissprot、PIR、PDF、PDB和NCBI RefSeq。根據(jù)NR注釋結(jié)果統(tǒng)計(jì)注釋基因的物種分布情況，結(jié)果（圖2）顯示，80.68%黃唇魚(yú)Unigenes能匹配到大黃魚(yú)（Larimichthys crocea）的相應(yīng)蛋白中，表明在所比對(duì)的魚(yú)類(lèi)中，黃唇魚(yú)與大黃魚(yú)的同源性最高，二者親緣關(guān)系最近;其次為深裂眶鋸雀鯛（Stegastes partitus）（2.98%）、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）（1.21%）和尼羅羅非魚(yú)（Oreochromis niloticus）（1.18%）;匹配到其他物種上的Unigege比例為13.95%。

2. 3 Unigene功能分類(lèi)結(jié)果

2. 3. 1 COG分類(lèi) COG是直系同源家族蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)COG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)可進(jìn)行功能注釋、歸類(lèi)及蛋白進(jìn)化分析。黃唇魚(yú)轉(zhuǎn)錄組中被COG功能注釋的Unigenes共12572條，而這些Unigenes又被分成25個(gè)類(lèi)別（圖3）。其中，與功能預(yù)測(cè)類(lèi)相關(guān)的Unigene數(shù)量最多（4680條，占37.23%）;其次是與轉(zhuǎn)錄（2015條，占16.03%），復(fù)制、重組和修復(fù)（1988條，占15.81%），翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成（1821條，占14.48%），信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制（1468條，占11.68%），翻譯后修飾、蛋白折疊和分子伴侶（1296條，10.31%）等基因工程類(lèi)相關(guān)的Unigene;與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)類(lèi)序列細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞分裂和染色體分區(qū)（1515條，12.05%）及代謝類(lèi)序列碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝（1419條，11.29%）相關(guān)的Unigene數(shù)量也較多;而與核結(jié)構(gòu)相關(guān)的Unigene數(shù)量最少，僅有6條。

2. 3. 2 GO分類(lèi) GO是一個(gè)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的基因功能分類(lèi)體系，利用GO數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析可將Unigenes分為生物工程、細(xì)胞組分和分子功能三大功能類(lèi)別。由圖4可看出，生物工程過(guò)程可細(xì)分為25類(lèi)，其中與細(xì)胞進(jìn)程相關(guān)的Unigene數(shù)量最多（1804條），其次是與單細(xì)胞生物進(jìn)程相關(guān)的Unigene（1535條），與細(xì)胞殺傷相關(guān)的Unigene數(shù)量最少（1條）;細(xì)胞組分可細(xì)分為18類(lèi)，其中與細(xì)胞（1291條）、細(xì)胞部分（1271條）和細(xì)胞膜（1046條）相關(guān)的Unigene數(shù)量較多，而與細(xì)胞外基質(zhì)組分（1條）、病毒顆粒（4條）和病毒顆粒部分（4條）相關(guān)的Unigene數(shù)量最少;分子功能可細(xì)分為14類(lèi)，其中與結(jié)合相關(guān)的Unigene數(shù)量最多（1628條），其次是與催化活性相關(guān)的Unigene（1020條），與化學(xué)排斥物活性和蛋白標(biāo)簽相關(guān)的Unigene數(shù)量最少，均為1條。

2. 3. 3 KEGG分類(lèi) KEGG是處理基因組、生物通路、疾病、藥物和化學(xué)物質(zhì)間聯(lián)系的集成數(shù)據(jù)庫(kù)。本研究根據(jù)功能不同，將KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)劃分為細(xì)胞過(guò)程、環(huán)境信息處理、基因信息處理、人類(lèi)疾病、新陳代謝和生物系統(tǒng)六大通徑，并細(xì)分為44類(lèi)（圖5）。通過(guò)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析，得到注釋的Unigene共31228條。其中，與信號(hào)分子和相互作用相關(guān)的Unigene數(shù)量最多（5843條），其次是與癌癥在視圖相關(guān)的Unigene，有3288條，而與生物合成和次生代謝物相關(guān)的Unigene數(shù)量最少，僅19條。

2. 4 SSR特征分析結(jié)果

通過(guò)MISA對(duì)黃唇魚(yú)的Unigene進(jìn)行SSR搜索，共檢測(cè)到29797個(gè)SSR位點(diǎn)分布于19664條Unigenes中。其中，最主要的重復(fù)類(lèi)型為二核苷酸重復(fù)基元（11855個(gè)，占39.79%），其次是單核苷酸重復(fù)基元（9695個(gè)，占32.54%）和三核苷酸重復(fù)基元（6663個(gè)，22.36%），而四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復(fù)基元的數(shù)量相對(duì)較少（圖6）。二核苷酸和三核苷酸重復(fù)基元種類(lèi)較豐富，分別有4和10種。在二核苷酸重復(fù)基元類(lèi)型中重復(fù)最多的基序是AC/GT（8355條），在三核苷酸重復(fù)基元類(lèi)型中重復(fù)最多的基序是AGG/CCT（1866條）。在6種核苷酸重復(fù)基元分布中，單核苷酸重復(fù)基元次數(shù)分布在12～132次，二核苷酸重復(fù)基元次數(shù)分布在6～74次，三核苷酸重復(fù)基元次數(shù)分布在5～49次，四核苷酸重復(fù)基元次數(shù)分布在5～33次，五核苷酸重復(fù)基元次數(shù)分布在4～13次，六核苷酸重復(fù)基元次數(shù)分布在4～12次，其中在6種核苷酸重復(fù)基元類(lèi)型中均可見(jiàn)的重復(fù)次數(shù)為12次，而重復(fù)次數(shù)最多的為6次。

2. 5 SSR引物有效性驗(yàn)證和多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果

在SSR引物預(yù)擴(kuò)增試驗(yàn)中，以合成的186對(duì)SSR引物對(duì)6尾黃唇魚(yú)基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物以3.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果篩選出121對(duì)能擴(kuò)增出目的條帶的SSR引物，擴(kuò)增成功率達(dá)65.05%。將121對(duì)SSR引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至廣州擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序和多態(tài)性檢測(cè)，經(jīng)比對(duì)分析最終篩選出47對(duì)擴(kuò)增穩(wěn)定性好且具有多態(tài)性的SSR引物（表2），多態(tài)性比例為38.84%，其中以二核苷酸和四核苷酸重復(fù)基元的擴(kuò)增結(jié)果居多。

3 討論

黃唇魚(yú)是我國(guó)特有種，但近年來(lái)因環(huán)境污染及過(guò)度捕撈等原因，導(dǎo)致其資源量急劇下降，因此，亟需開(kāi)展黃唇魚(yú)保護(hù)遺傳學(xué)的相關(guān)研究。本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)黃唇魚(yú)轉(zhuǎn)錄組遺傳資源進(jìn)行挖掘，共獲得13.43 Gb數(shù)據(jù)，經(jīng)組裝并去冗余后得到65047條Unigenes，其總長(zhǎng)度為69382127 bp，平均長(zhǎng)度為1066 bp，N50為2032 bp，GC含量為46.65%，表明黃唇魚(yú)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)具有較高質(zhì)量，可為開(kāi)展黃唇魚(yú)保護(hù)遺傳學(xué)研究提供支撐。在黃唇魚(yú)基因組信息缺乏的情況下，利用BLAST對(duì)組裝獲得的Unigenes進(jìn)行七大功能數(shù)據(jù)庫(kù)（NR、NT、GO、COG、KEGG、Swissprot和Interpro）注釋，共有55583條Unigenes被注釋（占85.45%），通過(guò)Unigene注釋可為黃唇魚(yú)功能基因的發(fā)掘提供參考序列。尤其是通過(guò)GO、COG和KEGG功能分類(lèi)及代謝通路等分析，不僅可為黃唇魚(yú)相關(guān)基因克隆及功能分析等提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，還能為其保護(hù)遺傳學(xué)研究提供大量可利用的基因資源。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是開(kāi)發(fā)SSR分子標(biāo)記的一種有效方法，目前已從橄欖蚌（Solenaia oleivor）（徐艷，2014）、施氏鱘（Acipenser schrenckii）（孔杰等，2015）、翹嘴鱖（Siniperca chuatsi）（袁文成，2015）、安吉小鯢（Hynobius amjiensis）（王宇等，2017）和中華蜜蜂（Apiscerana cerana）（熊翠玲等，2017）的轉(zhuǎn)錄組成功開(kāi)發(fā)出大量SSR分子標(biāo)記。本研究通過(guò)對(duì)黃唇魚(yú)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，檢測(cè)到29797個(gè)SSR位點(diǎn)分布于19664條Unigenes中。黃唇魚(yú)高通量測(cè)序結(jié)果顯示這些SSR位點(diǎn)類(lèi)型呈多樣性，包含單核苷酸～六核苷酸重復(fù)基元，且不同重復(fù)類(lèi)型的數(shù)量差異明顯，其中，最多的重復(fù)類(lèi)型為二核苷酸重復(fù)基元，其次是單核苷酸和三核苷酸重復(fù)基元。在二核苷酸重復(fù)基元類(lèi)型中重復(fù)最多的基序是AC/GT，占二核苷酸重復(fù)基元的70.48%，與在團(tuán)頭魴（Megalobrama amblycephala）（曾聰?shù)龋?013）和翹嘴鱖（S. chuatsi）（袁文成，2015）上的研究結(jié)果相同，但與許多植物以單核苷酸重復(fù)基元為主的結(jié)論不同，說(shuō)明不同物種的堿基重復(fù)基序存在種屬差異。

本研究從隨機(jī)挑選的186對(duì)SSR引物中篩選出121對(duì)能擴(kuò)增出目的條帶的SSR引物，擴(kuò)增成功率達(dá)65.05%。進(jìn)一步進(jìn)行測(cè)序分析和多態(tài)性檢測(cè)，結(jié)果篩選出47對(duì)擴(kuò)增穩(wěn)定性好且具有多態(tài)性的SSR引物，多態(tài)性比例為38.84%。本研究中黃唇魚(yú)SSR多態(tài)性引物擴(kuò)增效率不高的原因可能是：（1）隨機(jī)篩選的SSR引物存在不均性;（2）某些序列拼接錯(cuò)誤或引物設(shè)計(jì)質(zhì)量不高;（3）用于多態(tài)性驗(yàn)證的黃唇魚(yú)樣本數(shù)量較少導(dǎo)致群體等位基因數(shù)和遺傳多樣性相應(yīng)較低，但具體原因有待進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序能有效篩選出具有多樣性的黃唇魚(yú)SSR分子標(biāo)記，可為黃唇魚(yú)遺傳多樣性分析、親緣鑒定和遺傳圖譜構(gòu)建等后續(xù)研究提供基礎(chǔ)資料。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）