美洲大蠊多肽PAP—2對H22荷瘤小鼠的抑瘤作用研究

呂鴻 王瑤 張蕊 張鴻翰 彭芳

摘 要 目的：探討美洲大蠊多肽PAP-2對H22荷瘤小鼠的抑瘤作用。方法：通過小鼠腋窩皮下注射H22肝癌小鼠腹水構(gòu)建荷瘤小鼠模型。將70只小鼠隨機(jī)分為模型組（生理鹽水）、5-氟尿嘧啶組（陽性藥對照，20 mg/kg）以及美洲大蠊提取物的脫脂膏組（200 mg/kg，以提取物量計(jì)）、CⅡ-3組（從浸膏中提取的以多肽為主要活性成分的組分，200 mg/kg，以提取物量計(jì)）和多肽PAP-2高、中、低劑量組（從CⅡ-3中分離得到，200、100、50 mg/kg，以單體量計(jì)），每組10只。5-氟尿嘧啶組小鼠隔天腹腔注射給藥1次，其余各組小鼠均每天灌胃給藥1次，給藥周期均為10 d。給藥結(jié)束后，觀察小鼠瘤塊變化并測定其臟器（脾、胸腺、肝）指數(shù)，蘇木精-伊紅染色后觀察其瘤組織病理變化，并采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法測定其血清中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）和IL-4的含量。結(jié)果：脫脂膏、CⅡ-3和不同劑量的PAP-2均能不同程度地抑制荷瘤小鼠瘤塊的生長并升高其臟器指數(shù)，且PAP-2的作用具有一定的量效關(guān)系。其中，PAP-2高劑量組的抑瘤率（38.95%）顯著高于脫脂膏組和CⅡ-3組（P<0.05），并與5-氟尿嘧啶組（40.87%）接近（P>0.05）；PAP-2高劑量組小鼠脾指數(shù)、胸腺指數(shù)、肝指數(shù)較模型組均顯著升高（P<0.05），并顯著高于CⅡ-3組（P<0.05），且其肝指數(shù)顯著高于脫脂膏組（P<0.05）。此外，PAP-2還可降低荷瘤小鼠血清中VEGF和IL-4含量、升高其血清中IL-1β含量，其中PAP-2高劑量組與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；并且PAP-2高劑量組小鼠血清中IL-1β含量顯著高于脫脂膏組和CⅡ-3組（P<0.05），IL-4含量顯著低于脫脂膏組和CⅡ-3組（P<0.05），但是其血清中VEGF含量顯著低于脫脂膏組和CⅡ-3組（P<0.05）。結(jié)論：美洲大蠊多肽PAP-2對H22荷瘤小鼠具有一定的抑瘤作用，可升高其臟器指數(shù)，降低其血清中VEGF、IL-4含量并升高其血清中IL-1β含量。

關(guān)鍵詞 美洲大蠊多肽PAP-2；脫脂膏；CⅡ-3；H22荷瘤小鼠；抗腫瘤

Study on Anti-tumor Effects of Periplaneta americana Polypeptide PAP-2 on H22 Tumor-bearing Mice

LYU Hong， WANG Yao， ZHANG Rui， ZHANG Honghan， PENG Fang（College of Pharmacy and Chemistry， Dali University， Yunnan Dali 671000， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate anti-tumor effects of Periplaneta americana polypeptide PAP-2 on H22 tumor-bearing mice. METHODS： The mice tumor-bearing model was established by subcutaneous injection of ascites of H22 hepatocellular carcinoma mice via axilla. 70 mice were randomly divided into model group （normal saline）， 5-FU group （positive drug control， 20 mg/kg）， P. americana extract skimmed cream group （200 mg/kg， calculated by extract）， CⅡ-3 group （polypeptide isolated from skimmed cream as main active ingredient， 200 mg/kg， calculated by extract） and polypeptide PAP-2 high-dose， medium-dose and low-dose groups （isolated from CⅡ-3， 200， 100， 50 mg/kg， calculated by monomer）， with 10 mice in each group. The mice in the 5-FU group were given intraperitoneal injection once every other day， while the mice in the other groups were given intragastric administration once a day， the administration cycle was 10 d. After medication， the changes of tumor were observed and the organs （spleen， thymus and liver） index were measured. Histopathological changes of tumor tissue were observed after HE staining. The contents of VEGF， IL-1β and IL-4 in serum were determined by ELISA. RESULTS： Skimmed cream， CⅡ-3 and different doses of PAP-2 could inhibit the growth of tumor in tumor-bearing mice to different extent and increase organ index， and PAP-2 showed a dose-effect relationship. The tumor inhibition rate （38.95%） of PAP-2 high dose group was significantly higher than those of skimmed cream group and CⅡ-3 group （P<0.05）， which was close to that （40.87%） of 5-FU group （P>0.05）. Spleen index， thymus index and liver index of mice in PAP-2 high dose group were significantly those of model group and CⅡ-3 group （P<0.05）； and the liver index of mice in PAP-2 high dose group was significantly higher than that of skimmed cream group （P<0.05）. In addition， PAP-2 could decrease the serum contents of VEGF and IL-4， and increased serum content of IL-1β， with high dose group showed significant difference compared with model group （P<0.05）； the serum content of IL-1β of mice in PAP-2 high dose group was significantly higher the that of skimmed cream group and CⅡ-3 group （P<0.05）， serum contnet of IL-4 in PAP-2 high dose group was significantly lower the that of skimmed cream group and CⅡ-3 group （P<0.05）， but the serum content in which was significantly lower than that of skimmed cream group and CⅡ-3 group（P<0.05）. CONCLU- SIONS： P. americana polypeptide PAP-2 it has a certern anti-tumor effects on H22 tumor-bearing mice， and its can increase the index of organs of H22 tumor-bearing mice， decrease the contents of VEGF and IL-4 in serum， increase the content of IL-1β in serum.

KEYWORDS Periplaneta americana polypeptide PAP-2； Skimmed cream； CⅡ-3； H22 tumor-bearing mice； Anti-tumor

肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是世界上的惡性腫瘤之一，位居全球癌癥死亡的第2位[1]。HCC的早期發(fā)現(xiàn)較難，且無法根治[2]。目前，其發(fā)生和轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚不明確[3]，且易受到腫瘤細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子和生長因子等的影響，導(dǎo)致其自身的信號通路被破壞，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長，進(jìn)而促進(jìn)和導(dǎo)致癌癥的發(fā)生、發(fā)展[4]。美洲大蠊（Periplaneta americana L.）具有促修復(fù)、抗炎殺菌、保護(hù)心血管和肝臟以及增強(qiáng)免疫等藥理作用[5-10]。本課題組前期用95%乙醇為溶劑對美洲大蠊進(jìn)行提取，通過水浴加熱、去除油脂等操作后得到棕黑色膏狀物，并將其命名為脫脂膏；接著通過上聚酰胺柱等方式又從浸膏中分離得到了一種以肽類為主的物質(zhì)，并命其名為 CⅡ-3。經(jīng)過前期大量的藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)，已證實(shí)美洲大蠊脫脂膏和CⅡ-3具有較好的抗腫瘤作用[11-15]。在系統(tǒng)的深入研究中，本課題組經(jīng)過多肽/糖肽物質(zhì)藥效組分的分離、純化，以及通過高效液相色譜、質(zhì)譜等技術(shù)手段，又從CⅡ-3中提取分離得到了一種全新的多肽PAP-2，并且已證實(shí)其具有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD）肽特征。本研究將對此全新多肽PAP-2在體內(nèi)的抗腫瘤活性進(jìn)行研究，并與美洲大蠊粗提物脫脂膏和 CⅡ-3進(jìn)行比較，旨在為開發(fā)抗惡性腫瘤的天然美洲大蠊多肽藥物提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

255939酶標(biāo)儀（美國Bio-Tek公司）；CKX41SF倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；BSC-1000IIA2二級生物安全柜（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）。

1.2 藥品與試劑

美洲大蠊多肽PAP-2（純度：≥98%）、CⅡ-3（得率為0.2%）[15]和脫脂膏（由浸膏到脫脂膏的收率均數(shù)約為75.18%）[16]均由大理大學(xué)昆蟲生物醫(yī)藥研究院張成桂博士提供；胎牛血清（FBS）、RPMI 1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；5-氟尿嘧啶（5-FU，美國Sigma公司，批號：WXBC0190，純度：99%）；鼠血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒、鼠白細(xì)胞介素4（IL-4）ELISA試劑盒（中國艾博泰克生物公司，批號：9670018307、9677316820）；鼠IL-1β ELISA試劑盒（深圳市達(dá)科為生物技術(shù)股份有限公司，批號：9670018200）。

1.3 細(xì)胞

H22肝癌腹水細(xì)胞株由大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院藥理教研室提供。

1.4 動(dòng)物

SPF級Balb/c小鼠70只，♀♂各半，體質(zhì)量18～22 g，購于昆明楚商科技有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號：43004700028293。

2 方法

2.1 藥液的制備

將美洲大蠊提取物脫脂膏、CⅡ-3和多肽PAP-2均用生理鹽水制備成20 mg/mL的母液，4 ℃保存?zhèn)溆茫瑢?shí)驗(yàn)時(shí)再稀釋到所需濃度。將5-FU用生理鹽水制備成2 mg/mL的母液，4 ℃短期保存。

2.2 H22荷瘤小鼠模型的構(gòu)建

移植原代H22肝癌細(xì)胞于小鼠腹腔，并傳代6 d，無菌抽取第2代小鼠腹水，以生理鹽水稀釋，0.4%臺盼藍(lán)計(jì)數(shù)，當(dāng)細(xì)胞活力>95%后，取細(xì)胞密度為1×107 mL-1的細(xì)胞懸液0.2 mL，于小鼠右腋窩處接種，當(dāng)小鼠腋窩處出現(xiàn)明顯瘤組織時(shí)即造模成功。

2.3 分組與給藥

將造模成功的70只小鼠隨機(jī)分為10組，每組10只（♀♂各半），分別為模型組（生理鹽水）、5-FU組（陽性藥對照，20 mg/kg）以及美洲大蠊提取物的脫脂膏組（200 mg/kg，以提取物量計(jì)）、CⅡ-3組（從浸膏中提取的以多肽為主要活性成分的組分，200 mg/kg，以提取物量計(jì)）和多肽PAP-2高、中、低劑量組（從CⅡ-3中分離得到，200、100、50 mg/kg，以單體量計(jì)）[17]，每組10只。5-FU組小鼠隔天腹腔注射5-FU（0.2 mL/只）1次，其余各組小鼠均每天灌胃相應(yīng)藥物（0.2 mL/只）1次，均連續(xù)給藥10 d。

2.4 抑瘤率及臟器指數(shù)的測定

小鼠末次給藥24 h后，眼眶取血，然后脫頸椎處死，剝?nèi)×鰤K及臟器（脾、胸腺和肝），按下列公式計(jì)算抑瘤率及臟器指數(shù)：抑瘤率（%）=（模型組小鼠平均瘤質(zhì)量-實(shí)驗(yàn)組小鼠平均瘤質(zhì)量）/模型組小鼠平均瘤質(zhì)量×100%；臟器指數(shù)=臟器（脾、胸腺和肝）質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（0.1 g）。

2.5 腫瘤組織的病理學(xué)觀察

將腫瘤組織常規(guī)處理，經(jīng)包埋、切片、貼片、蘇木精-伊紅（HE）染色后[18]，于倒置相差顯微鏡下觀察標(biāo)本病理學(xué)改變。

2.6 血清中VEGF、IL-1β、IL-4含量的測定

小鼠眼眶取血后，將全血于4 ℃環(huán)境下放置2 h，然后在4 ℃條件下以4 000 r/min離心15 min，吸取上清，置于-20 ℃冰箱中保存，備用。采用ELISA法測定各組小鼠血清中VEGF、IL-1β、IL-4的含量，具體操作按照相應(yīng)說明書進(jìn)行。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 小鼠瘤質(zhì)量及抑瘤率測定結(jié)果

與模型組比較，各給藥組小鼠的瘤質(zhì)量均顯著降低（P<0.05），且PAP-2對腫瘤生長的抑制作用呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。其中，高劑量PAP-2的抑瘤作用顯著強(qiáng)于脫脂膏和CⅡ-3，瘤質(zhì)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；并且，高劑量PAP-2的抑瘤作用與5-FU接近，兩組小鼠瘤質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。各組小鼠瘤質(zhì)量及抑瘤率測定結(jié)果見表1。

3.2 小鼠臟器指數(shù)測定結(jié)果

與模型組比較，5-FU組小鼠的脾指數(shù)、胸腺指數(shù)和肝指數(shù)均不同程度降低，其中脾指數(shù)和肝指數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示5-FU對小鼠臟器有一定的損傷；而其余各給藥組小鼠的脾指數(shù)、胸腺指數(shù)和肝指數(shù)均不同程度升高，其中PAP-2高、中劑量組小鼠的脾指數(shù)、胸腺指數(shù)、肝指數(shù)以及脫脂膏組小鼠的脾指數(shù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。并且PAP-2的作用具有一定的量效關(guān)系，PAP-2高劑量組小鼠的脾指數(shù)、胸腺指數(shù)和肝指數(shù)均顯著高于CⅡ-3組（P<0.05），肝指數(shù)顯著高于脫脂膏組（P<0.05）。各組小鼠脾指數(shù)、胸腺指數(shù)和肝指數(shù)測定結(jié)果見表2。

3.3 小鼠腫瘤組織切片HE染色觀察結(jié)果

模型組小鼠可見明顯的腫瘤組織結(jié)構(gòu)，腫瘤細(xì)胞排列緊密，核大深染，大小不等，形態(tài)多樣，異型明顯。與模型組比較，5-FU組小鼠腫瘤細(xì)胞排列疏松，可見大面積的壞死；PAP-2高、中、低劑量組小鼠腫瘤細(xì)胞排列逐漸疏松，且隨著PAP-2劑量的增加，其腫瘤細(xì)胞壞死區(qū)域明顯增大；CⅡ-3組和脫脂膏組小鼠腫瘤組織也可見細(xì)胞壞死，但壞死程度輕于PAP-2高劑量組。各組小鼠腫瘤組織的HE染色結(jié)果見圖1。

3.4 小鼠血清中VEGF、IL-1β、IL-4含量測定結(jié)果

與模型組比較，各給藥組小鼠血清中VEGF、IL-4含量均不同程度降低，IL-1β含量均不同程度升高。其中，PAP-2高劑量組、CⅡ-3組和脫脂膏組小鼠血清中VEGF含量和5-FU組、PAP-2高劑量組小鼠血清中IL-1β含量以及5-FU組、PAP-2各劑量組小鼠血清中IL-4含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。PAP-2高劑量組小鼠血清中VEGF含量顯著高于脫脂膏組和CⅡ-3組（P<0.05）；但其血清中IL-1β含量顯著高于脫脂膏組和CⅡ-3組，IL-4含量顯著低于脫脂膏組和CⅡ-3組（P<0.05）。各組小鼠血清中VEGF、IL-1β、IL-4含量測定結(jié)果見表3。

4 討論

本研究利用H22細(xì)胞株構(gòu)建Balb/c小鼠腋下移植瘤小鼠模型，進(jìn)行了PAP-2的體內(nèi)抑瘤作用研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，美洲大蠊多肽PAP-2可使腫瘤細(xì)胞排列逐漸疏松，且隨著PAP-2劑量的增加，其腫瘤細(xì)胞壞死區(qū)域明顯增加，高劑量PAP-2（200 mg/kg）的抑瘤率達(dá)38.95%，接近于陽性對照藥5-FU，且PAP-2的抑瘤效果顯著優(yōu)于脫脂膏和CⅡ-3。此外，PAP-2還可升高H22荷瘤小鼠的臟器（脾、胸腺、肝）指數(shù)，從而升高荷瘤小鼠的免疫力，達(dá)到抑瘤作用[19]，并且高劑量PAP-2的作用效果優(yōu)于脫脂膏和CⅡ-3。

VEGF是目前發(fā)現(xiàn)的最重要的促血管生成因子。正常情況下，機(jī)體的免疫系統(tǒng)發(fā)揮免疫作用后對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行重塑，但同時(shí)腫瘤細(xì)胞也相應(yīng)會釋放出免疫抑制細(xì)胞及因子來對抗免疫細(xì)胞的作用，從而導(dǎo)致免疫抑制微環(huán)境的形成，在該微環(huán)境中免疫細(xì)胞的功能下降，促進(jìn)了VEGF的表達(dá)，使得新生血管形成，導(dǎo)致了腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。美洲大蠊多肽PAP-2可降低H22荷瘤小鼠血清中VEGF的含量，并呈一定的量效關(guān)系，但是其作用不及脫脂膏和CⅡ-3。IL-4主要由活化T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，在小鼠中由輔助性T細(xì)胞（Th2）亞群產(chǎn)生，可促進(jìn)體液免疫。T細(xì)胞能夠促進(jìn)γ干擾素（IFN-γ）、IL-1的分泌，IL-1與IL-4相互制約達(dá)到平衡，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能。腫瘤發(fā)生時(shí)，IL-1水平會顯著減低，而IL-4水平明顯上升[20]。有研究顯示，IL-1β可促進(jìn)炎癥反應(yīng)[21-22]，其可招募中性粒細(xì)胞積聚到腫瘤細(xì)胞周圍，從而抑制腫瘤的生長[23]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，美洲大蠊多肽PAP-2可提高小鼠血清中IL-1β的含量，下調(diào)其血清中IL-4的含量，提示其可能具有調(diào)節(jié)細(xì)胞因子分泌、改善Th1/Th2的平衡、促進(jìn)免疫應(yīng)答過程中Th2/Th1型偏移，增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能，從而起到有效抑制腫瘤生長效應(yīng)的作用；同時(shí)，其又可以通過減少荷瘤小鼠血清中VEGF的含量，從而抑制腫瘤的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，美洲大蠊多肽PAP-2可升高荷瘤小鼠的臟器指數(shù)，下調(diào)其血清中VEGF、IL-4含量并升高其血清中IL-1β含量，對H22荷瘤小鼠具有一定的抑瘤作用，且其作用優(yōu)于美洲大蠊提取物脫脂膏和CⅡ-3，具有一定的開發(fā)價(jià)值，但是其具體的抗腫瘤機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2018-12-10 修回日期：2019-01-12）

（編輯：林 靜）