LC—MS/MS法同時測定艾司奧美拉唑鈉原料藥及其制劑中3種雜質的含量

劉克鋒 劉宇 王雪芹 趙杰

摘 要 目的：建立同時測定艾司奧美拉唑鈉原料藥及其制劑中雜質E、雜質Ⅰ和雜質Ⅳ含量的方法。方法：采用液相色譜-串聯質譜法。色譜柱為Agela VenusiL MP C18，流動相為乙腈-水（梯度洗脫），流速為0.2 mL/min，柱溫為35 ℃，進樣量為1 μL；離子源為電噴霧離子源，檢測方式為負離子模式，工作模式為多反應監測模式，用于定量分析的離子對分別為m/z 360.1→194.0（雜質E）、m/z 375.8→210.7（雜質Ⅰ）、m/z 330.2→312.1（雜質Ⅳ）。結果：雜質E、雜質Ⅰ、雜質Ⅳ檢測質量濃度的線性范圍分別為0.001 26～0.044 80 μg/mL（r=0.994 7）、0.001 34～0.045 2 μg/mL（r=0.992 8）、0.018 9～1.260 00 μg/mL（r=0.991 4）；定量限分別為0.001 26、0.001 34、 0.018 9 μg/mL，檢測限分別為0.000 41、0.000 44、0.006 3 μg/mL；精密度、重復性試驗的RSD均小于4%，穩定性試驗雜質E、雜質Ⅰ的RSD<10%（n=5），雜質Ⅳ的RSD>15%（n=7）；加樣回收率分別為87.69%～100.72%（RSD=4.29%，n=9）、90.04%～100.63%（RSD=3.67%，n=9）、93.58%～101.86%（RSD=2.66%，n=9）。結論：該方法準確、快速、靈敏、專屬性強，可用于同時測定艾司奧美拉唑鈉原料藥及其制劑中3種雜質的含量。

關鍵詞 艾司奧美拉唑鈉；雜質E；雜質Ⅰ；雜質Ⅳ；液相色譜-串聯質譜法；含量測定

Simultaneous Determination of 3 Impurities in Crude Drug and Preparation of Esomeprazole Sodium by LC-MS/MS

LIU Kefeng1，LIU Yu1，WANG Xueqin2，ZHAO Jie1（1. Dept. of Pharmacy，the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University， Zhengzhou 450002， China； 2. Henan Provincial Institute for Food and Drug Control， Zhengzhou 450003， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for simultaneous determination of impurity E， impurity Ⅰ and impurity Ⅳ in crude drug and preparation of esomeprazole sodium. METHODS： LC-MS/MS method was adopted. The separation was performed on Agela VenusiL MP C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-water （gradient elution） at the flow rate of 0.2 mL/min. The column temperature was 35 ℃， and the sample size was 1 μL； analytes were analyzed by electro-spray ionization （ESI） in the multiple reaction monitoring mode， negative ion. The precursors of production transitions m/z 360.1→194.0 （impurity E）， m/z 375.8→210.7 （impurity Ⅰ）， m/z 330.2→312.1 （impurity Ⅳ） were used to measure impurity. RESULTS： The linear range of impurity E， impurity Ⅰ and impurity Ⅳ were 0.001 26-0.044 80 μg/mL （r=0.994 7）， 0.001 34-0.045 2 μg/mL （r=0.992 8） and 0.018 9-1.260 00 μg/mL （r=0.991 4）. The limit of quantitation were 0.001 26， 0.001 34， 0.018 9 μg/mL； the detection limits were 0.000 41， 0.000 44， 0.006 3 μg/mL. RSDs of precision and reproducibility tests were all lower than 4%； RSDs of stability tests of impurity E and impurity Ⅰ were all lower than 10%（n=5）， and that of impurity Ⅳ was higher than 15% （n=7）. The average recoveries were 87.69%-100.72% （RSD=4.29%， n=9）， 90.04%-100.63%（RSD=3.67%，n=9）and 93.58%-101.86%（RSD=2.66%，n=9）. CONCLUSIONS： The method is accurate， rapid， sensitive， selective and suitable for the content determination of 3 impurities in crude drug and preparation of esomeprazole sodium.

KEYWORDS Esomeprazole sodium； Impurity E； Impurity Ⅰ； Impurity Ⅳ； LC-MS/MS； Content determination

質子泵抑制劑艾司奧美拉唑（Esomeprazole）為奧美拉唑的S-異構體，是質子泵抑制劑家族中第一個單一光學異構體。該藥可用于糜爛性反流性食管炎、已經治愈的食管炎患者防止復發的長期維持治療、胃潰瘍、十二指腸潰瘍，其與抗菌藥物聯用可根除幽門螺桿菌及愈合十二指腸潰瘍、防止潰瘍復發[1-2]。

艾司奧美拉唑在工藝生產及貯存過程中可產生3個雜質：奧美拉唑氮氧化物（雜質E），化學名為5-甲氧基-2{[（4-甲氧基-3，5-二甲基-2-吡啶基）甲基]磺酰基}-1H-苯并咪唑；奧美拉唑砜氮氧化物（雜質Ⅰ），化學名為6-甲氧基-2-{[（4-甲氧基-3，5-二甲基-1-氧代-2-吡啶基）甲基]磺酰基}-1H-苯并咪唑；H215（雜質Ⅳ），化學名為2-{[（5-甲氧基-1H-苯并咪唑-2-基）亞硫酰基]甲基}-3，5-二甲基-4（1H）-1-吡啶酮；其中雜質E、雜質Ⅰ為基因毒性雜質，雜質Ⅳ穩定性較差；2015年版《中國藥典》（二部）[3]中有關物質檢查項中所列雜質中未包含雜質E和雜質Ⅰ。目前，有關物質檢查常用方法為高效液相色譜法[3]，但該方法分析時間較長，靈敏度有限，不能滿足毒性雜質和穩定性較差雜質的檢查要求。為此，筆者根據《化學藥物雜質研究技術指導原則》[4]、人用藥品注冊技術要求國際協調會（ICH）相關規定[5-6]，并參考有關文獻[7-12]，建立了同時測定艾司奧美拉唑鈉原料藥及其制劑中雜質E、雜質Ⅰ、雜質Ⅳ含量的液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS），旨在為其質量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-30A型液相色譜儀，包括LC-30AD泵、SIL-30AC進樣器、CTO-30A柱溫箱（日本Shimadzu公司）；AB Sciex4500型三重四極桿串聯質譜儀，包括電噴霧離子源、Analyst 1.6.3色譜工作站（美國AB公司）；XR 205 SM-DR型電子天平（瑞士Precisa公司）；移液器（德國Eppendorf公司）。

1.2 藥品與試劑

雜質E對照品（英國LGC公司，批號：57290，純度：99.50%）；雜質Ⅰ對照品（濟南蔚然生物科技有限公司，批號：WR-2017-601，純度：98.79%）；雜質Ⅳ對照品（美國CATO公司，批號：10C-11-7，純度：96.41%）；艾司奧美拉唑鈉原料藥（天方藥業有限公司，批號：17090801x 、17090802x 、17090803x，純度均為100%）；注射用艾司奧美拉唑鈉（美國Nexium公司，批號：PBTB，規格：40 mg）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜與質譜條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Agela VenusiL MP C18（100 mm×2.1 mm，3 μm）；流動相：水（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～3.0 min，45%A→30%A；3.0～4.0 min，30%A；4.0～6.0 min，30%A→10%A；6.0～6.1 min，10%A→45%A；6.1～8.0 min，45%A）；流速：0.2 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：1 μL。

2.1.2 質譜條件 離子源：電噴霧離子源；檢測方式：負離子模式；工作模式：多反應監測模式；氣簾氣：25 psi；離子噴霧電壓：-5 500 V；溫度：450 ℃；霧化氣：55 psi；輔助氣：55 psi；用于定量分析的離子對分別為m/z 360.1→194.0（雜質E）、m/z 375.8→210.7（雜質Ⅰ）、m/z 330.2→312.1（雜質Ⅳ），解簇電壓分別為-13.85、 -16.68、-13.38 V。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 精密稱取艾司奧美拉唑原料藥、雜質E、雜質Ⅰ、雜質Ⅳ對照品適量，分別置于10 mL量瓶中，加30%乙腈溶解并定容，制成艾司奧美拉唑鈉、雜質E、雜質Ⅰ、雜質Ⅳ質量濃度分別為1、0.037 5、0.037 5、1.0 mg/mL的單一貯備液。分別取上述各單一貯備液適量，分別置于10 mL量瓶中，加30%乙腈稀釋并定容，制成艾司奧美拉唑鈉、雜質E、雜質Ⅰ、雜質Ⅳ質量濃度分別為1、0.037 5、0.037 5、1.0 μg/mL的艾司奧美拉唑鈉及各單一雜質對照品溶液。取上述各單一雜質貯備液適量，置于同一10 mL量瓶中，加30%乙腈稀釋并定容，即得雜質E、雜質Ⅰ、雜質Ⅳ質量濃度分別為0.037 5、0.037 5、1.0 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取注射用艾司奧美拉唑鈉10 mg，置于10 mL量瓶中，加30%乙腈溶解并定容，搖勻，即得供試品溶液。

2.2.3 空白溶液 以30%乙腈為空白溶液。

2.3 專屬性試驗

取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液、空白溶液各1 μL，按“2.1”項下色譜與質譜條件進樣測定，記錄色譜圖，詳見圖1。由圖1可知，艾司奧美拉唑鈉、雜質E、雜質Ⅰ、雜質Ⅳ色譜峰出峰時間分別為4.45、3.00、3.62、2.18 min，空白溶液在相應位置未見色譜峰出現，對測定無干擾。

2.4 線性關系考察

取“2.2.1”項下各單一雜質貯備液適量，分別用30%乙腈稀釋，制成雜質E質量濃度分別為0.001 26、0.017 9、0.029 1、0.038 1、0.044 80 μg/mL，雜質Ⅰ質量濃度分別為0.001 34、0.022 6、0.029 4、0.038 42、0.045 2 μg/mL，雜質Ⅳ質量濃度分別為0.018 9、0.525 0、0.840 0、1.050 0、1.260 0 μg/mL的線性關系工作溶液，按“2.1”項下色譜與質譜條件進樣測定，記錄峰面積。以各待測成分質量濃度（x，μg/mL）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，回歸方程與線性范圍見表1。

2.5 定量限與檢測限考察

取“2.2.1”項下各單一雜質對照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1” 項下色譜與質譜條件進樣測定，以信噪比10 ∶ 1、3 ∶ 1分別計算定量限、檢測限。結果，雜質E、雜質Ⅰ、雜質Ⅳ的定量限分別為0.001 26、 0.001 34、0.018 9 μg/mL，檢測限分別為0.000 41、0.000 44、0.006 3 μg/mL。

2.6 精密度試驗

取“2.2.1”項下混合對照品溶液（雜質E、雜質Ⅰ、雜質Ⅳ質量濃度分別為0.037 5 、0.037 5、1.0 μg/mL）適量，按“2.1” 項下色譜與質譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果，雜質E、雜質Ⅰ、雜質Ⅳ峰面積的RSD分別為3.84%、3.94%、3.03%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：17090801x）適量，分別于室溫下放置0、1、2、3、4 h時按“2.1” 項下色譜與質譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，雜質E、雜質Ⅰ、雜質Ⅳ峰面積的RSD分別為6.60%、6.40%、16.40%（n=5）。另取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：17090801x）適量，分別于冷藏條件下放置0、1、2、3、4、5、6 h時按“2.1” 項下試驗條件進樣測定，記錄峰面積。結果，雜質E、雜質Ⅰ、雜質Ⅳ峰面積的RSD分別為6.51%、8.40%、21.62%（n=7）。表明，雜質E和雜質Ⅰ在室溫下放置4 h和冷藏下放置6 h穩定性較好，雜質Ⅳ在2種條件下均在放置1 h后峰面積明顯減小，且隨放置時間延長峰面積明顯下降，提示雜質Ⅳ的穩定性較差，溶液應臨用新制。

2.8 重復性試驗

取樣品（批號：17090801x）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項下試驗條件進樣測定，記錄峰面積并以外標法計算樣品中各雜質的含量。結果，雜質E、雜質Ⅰ、雜質Ⅳ的平均含量分別為 0.000 84%、0.000 22%、0.002 68%，RSD分別為2.24%、3.40%、1.80%（n=6），表明本方法重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗

精密稱取已準確測定雜質含量的樣品（批號：17090801x），共9份，每份約50 mg，分別置于50 mL量瓶中，加入一定量的單一雜質對照品溶液適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜與質譜條件進樣測定，記錄峰面積并以外標法計算加樣回收率，結果見表2。

2.10 耐用性試驗

2.10.1 色譜柱考察 取樣品（批號：17090801x）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜與質譜條件[色譜柱分別為Phenomenex Kinetex C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）、Agela VenusiL MP C18（100 mm×2.1 mm，3 μm）、Waters BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）]進樣測定，記錄峰面積并以外標法計算樣品含量，結果見表3。結果表明，當色譜柱發生一定程度變化時，本方法能滿足試驗要求，提示其耐用性良好。

2.10.2 流動相考察 取樣品（批號：17090801x）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜與質譜條件[流動相分別為水-乙腈（梯度洗脫）、0.01 mol/L醋酸銨-乙腈（梯度洗脫）、0.05 mol/L醋酸銨-乙腈（梯度洗脫）]進樣測定，記錄峰面積并以外標法計算樣品含量，結果見表3。結果表明，當流動相一定程度波動時，本方法能滿足試驗要求，提示其耐用性良好。

2.10.3 流速考察 取樣品（批號：17090801x）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜與質譜條件（流速0.15、0.20、0.25 mL/min）進樣測定，記錄峰面積并以外標法計算樣品含量，結果見表3。結果表明，當流速一定程度波動時，本方法能滿足試驗要求，提示其耐用性良好。

2.10.4 柱溫考察 取樣品（批號：17090801x）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜與質譜條件（柱溫30、35、40 ℃）進樣測定，記錄峰面積并以外標法計算樣品含量，結果見表2。結果表明，當柱溫一定程度波動時，本方法能滿足試驗要求，提示其耐用性良好。

2.11 樣品中雜質含量測定

取4批樣品適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜與質譜條件進樣測定，平行測定3次，記錄峰面積并以外標法計算樣品中雜質的含量，結果見表4{表中，“*”表示現行質量標準[2015年版《中國藥典》（二部）]規定雜質Ⅳ的限度為1.3%）}。

3 討論

雜質Ⅳ為降解氧化產物，該雜質易吸潮，吸潮后極易變質，在溶液中穩定性較差，用常規的高效液相色譜法進行有關物質檢查耗時較長（大約1 h以上，不同色譜柱略有差異）、重復性較差，加之雜質E和雜質Ⅰ在艾司奧美拉唑鈉樣品中的含量較低[13-16]，因此常規的高效液相色譜法的靈敏度不能滿足試驗要求，不能準確地檢測和控制樣品的含量，故采用LC-MS/MS法測定雜質E、雜質Ⅰ和雜質Ⅳ的含量。

雜質E為奧美拉唑氮氧化物，雜質Ⅰ為奧美拉唑砜氮氧化物，2015年版《中國藥典》（二部）未對二者進行控制，目前也尚未有文獻報道含量測定的方法。由于雜質E和雜質Ⅰ的分子結構中均含有N→O，故二者均具有一定的潛在基因毒性[4-6]。按照ICH指導原則，對具有基因毒性的雜質應嚴格控制，且要求雜質E和雜質Ⅰ的含量均不得超過0.003 75%，同時規定雜質Ⅳ的含量不得超過0.1%[5-6]。3種雜質均能在樣品中檢出，提示本研究所建立的方法可行。樣品中雜質E、雜質Ⅰ為基因毒性雜質，兩者含量均遠遠低于限值規定，在正常服用量時不會對人體產生影響。

合適的分析方法能準確地分辨與測定有毒雜質的含量，并綜合藥學、毒理學研究結果將其限度控制在一個安全、合理的范圍內，以保證藥品的質量及安全性[17]。由于3個雜質與艾司奧美拉唑鈉主成分的極性差別較大，且3個雜質檢測模式均采用負離子模式，而主成分采用正離子模式檢測（梯度洗脫），使得主成分在所有雜質之后出峰。本研究中，無論是室溫還是在低溫條件下，雜質E和雜質Ⅰ的穩定性均較好，雜質Ⅳ在放置1 h后峰面積明顯下降，穩定性較差，提示樣品溶液應臨用新制。

綜上所述，該方法準確、快速、靈敏、專屬性強，可用于同時測定艾司奧美拉唑鈉原料藥及其制劑中雜質E、雜質Ⅰ和雜質Ⅳ的含量。

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（收稿日期：2018-08-03 修回日期：2018-12-30）

（編輯：陳 宏）