冰片配伍黃芪甲苷與三七總皂苷抗腦缺血再灌注損傷 有效劑量的研究

楊筱倩　陳仙蕾　楊仁義　唐標　劉曉丹　鄧常清　黃小平

〔摘要〕 目的 探討冰片配伍黃芪甲苷（astragalosides Ⅳ， AST Ⅳ）和三七總皂苷（panax notoginseng saponins， PNS）抗腦缺血再灌注損傷的有效劑量。方法 采用U6*（64）均勻設計實驗，設立6個不同劑量的冰片、AST Ⅳ和PNS配伍，予大腦中動脈阻塞（middle cerebral artery occlusion， MCAO）再灌注大鼠灌胃干預，以神經功能評分、腦梗死率、腦含水量、腦組織病理形態、血腦屏障（blood-brain barrier， BBB）通透性評價藥物的作用，對效應指標進行多重線性回歸分析，確立3種組（成）分的有效配伍劑量，并在此基礎上進行驗證。結果 均勻設計實驗表明，大鼠腦缺血再灌注后，出現明顯的神經功能障礙，腦梗死率、腦含水量、神經細胞損傷率和BBB通透性均顯著增加。冰片、AST Ⅳ、PNS不同劑量配伍對上述指標均有一定的改善作用;多重線性回歸分析表明，冰片7.5 mg/kg、AST Ⅳ10 mg/kg、PNS25 mg/kg配伍為其抗腦缺血再灌注損傷的有效配伍劑量。驗證實驗顯示，3種藥物高、低劑量配伍能顯著降低腦缺血再灌注大鼠神經功能評分和腦梗死率，3種藥物配伍的效應顯著優于各藥物單用或AST Ⅳ+PNS配伍（P<0.05或P<0.01）。結論 冰片、AST Ⅳ、PNS配伍可增強抗腦缺血再灌注損傷的效應，3種藥物的有效配伍劑量為冰片7.5 mg/kg+AST Ⅳ 10 mg/kg+PNS 25 mg/kg。

〔關鍵詞〕 冰片;黃芪甲苷;三七總皂苷;腦缺血再灌注;配伍劑量

〔中圖分類號〕R285.5;R743? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.04.003

Study on the Effective Dosage of Borneol Combined with Astragalosides Ⅳ and Panax

Notoginseng Saponins Antagonizing Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury

YANG Xiaoqian， CHEN Xianlei， YANG Renyi， TANG Biao， LIU Xiaodan， DENG Changqing*， HUANG Xiaoping*

（Molecular Pathology Laboratory， Key Laboratory of Hunan Province for Prevention and Treatment of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine on Cardio-Cerebral Diseases， Key Laboratory of Hunan Universities for Cell Biology and Molecular Techniques， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕 Objective To explore the effective dosage of Borneol combined with Astragalosides Ⅳ （AST Ⅳ） and panax notoginseng saponins （PNS） antagonizing cerebral ischemia-reperfusion injury. Methods According to U6*（64） uniform design experiment， 6 different dosage combinations of Borneol， AST Ⅳ and PNS were set. The middle cerebral artery occlusion （MCAO）-reperfusion rats was administrated. The neurological function score， cerebral infarct volume， brain water content， brain histopathological morphology， blood-brain barrier （BBB） permeability were used to assess the effects of drugs. The effect index was analyzed using multiple linear regression method， thus to ascertain the effective combination dosage of 3 ingredients （components）， and the effective combination dosage were exerted to the experimental verification. Results The uniform design experiment results showed that the rats appeared obvious neurological dysfunction， cerebral infarction rate， brain water content， nerve cell injury rate and BBB permeability were all increased after cerebral ischemia-reperfusion. The different dosage combinations of Borneol， AST Ⅳ and PNS could improve the index above. Multiple linear regression analysis showed that the effective combination dosage of Borneol， AST Ⅳ and PNS antagonizing cerebral ischemia-reperfusion injury was Borneol 7.5 mg/kg， AST Ⅳ 10 mg/kg， PNS 25 mg/kg， respectively. Verification experiment results showed that 3 drug combinations with high or low dosage could significantly decrease neurological function score and cerebral infarct volume of cerebral ischemia-reperfusion rats， and the effects of the combinations were significantly better than that of single drug or AST Ⅳ+PNS （P<0.05 or P<0.01）. Conclusion The combinations of Borneol， AST Ⅳ and PNS can enhance the effects of anti-cerebral ischemia-reperfusion injury， and the effective combination dosage is Borneol 7.5 mg/kg+AST Ⅳ 10 mg/kg+PNS 25 mg/kg.

〔Keywords〕 Borneol; Astragalosides Ⅳ; panax notoginseng saponins; cerebral ischemia-reperfusion; combination dosage

腦梗死是由于腦組織動脈血管阻塞使其血供障礙，進而導致腦組織形態和功能受損，該病具有發病率高、致殘率高、死亡率高和復發率高等特點，嚴重危害了人類的健康[1]。研究表明[2-3]，腦組織在缺血再灌注后會發生更嚴重的損傷，這種損傷常由Ca2+超載、腦組織能量代謝紊亂、氧化應激損傷、炎癥反應等一系列變化引起，最終將導致神經細胞損傷甚至細胞死亡。

中醫學認為腦卒中的基本病機是虛、火、氣、血、風、痰，以氣虛和血瘀為主，氣虛血瘀為缺血性中風的主要病理機制，運用益氣活血法治療常可收到良好的療效[4]。針對缺血性中風的治療，臨床常以益氣藥黃芪和活血藥三七配伍使用，符合中醫學益氣活血的治療原則。藥物化學研究表明，黃芪總苷（astragalosides， AST）是黃芪中具有心腦血管藥理作用的主要藥效組分，主要含黃芪甲苷（astragalosides Ⅳ， AST Ⅳ）等;三七總皂苷（panax notoginseng saponins， PNS）是三七中具有心腦血管效應的主要藥效組分，主要含人參皂苷Rg1、Rb1和三七皂苷R1等。目前對AST和PNS兩類有效組分配伍的心腦血管效應研究已有相關報道，我們的研究發現，黃芪和三七中的主要有效組（成）分及其配伍可通過腦缺血后的多個病理生理環節，協同發揮抗腦缺血再灌注損傷的作用[5-8]。但AST給藥后主要分布于肝、脾、心、肺中，在腦組織中分布較少，難以穿透血腦屏障（blood-brain barrier， BBB）[9-10]。PNS給藥后，人參皂苷Rg1、Rb1及三七皂苷R1等主要分布于腎、肺、肝、心臟，在腦組織中含量均較少[11]。由此可見，AST和PNS的主要成分由于其分子量大、脂溶性低，透過BBB的量少，難以更好地在病變腦組織發揮藥效作用。冰片相對分子質量為154.24，是一種小分子脂溶性單萜類物質，不僅本身能透過BBB，還可促進其它藥物進入腦組織[12]，具有“引藥上行”的作用，常作為輔藥或引經藥使用以促進藥物吸收及進入病變部位，從而對腦相關疾病的治療發揮協同增效作用[13]。張青等[14]采用冰片400 mg/kg+黃芪40 mg/kg組合，發現冰片能開放腦缺血再灌注后BBB，促進藥物入腦。吳俊杰等[15]研究發現，冰片20 mg/kg+梓醇49 mg/kg+葛根素200 mg/kg可以增加腦缺血模型BBB通透性，并促進梓醇、葛根素透過BBB。因此，本研究采用大鼠腦缺血再灌注模型和功能、形態評價方法，探討冰片配伍AST Ⅳ和PNS抗腦缺血的增效作用，確立3種組（成）分配伍的有效劑量，為新型抗腦缺血中藥的開發與應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 主要試劑? 冰片（左旋龍腦，質量分數86%），購自本校附屬醫院藥劑科;AST IV（質量分數≥98%，批號：MUST-15032010）、PNS（質量分數≥98%，批號：MUST-14122912），均購自成都曼思特生物科技有限公司，藥物用時以0.5%羧甲基纖維素鈉配成相應濃度混懸液。2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium hloride， TTC，美國Sigma公司，批號：T8877-5G），水合氯醛（梯希愛化成工業發展有限公司，批號：8MQ20-CC），伊文思藍（美國Sigma公司，批號：314-13-6），PBS（Solarbio公司，批號：P1010）。

1.1.2? 動物? SPF級雄性SD大鼠，體質量200～250 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供（動物合格證號：43004700037715）。飼養于湖南中醫藥大學動物實驗中心[場地許可證號：SKY（湘）2013-0005]。實驗前適應性喂養飼養5～7 d，給藥前禁食12 h，自由飲水。

1.2? 方法

1.2.1? 藥物劑量、配制、分組與干預? 根據《中華人民共和國藥典》記載，冰片成人每天用量為0.15～0.3 g，大鼠的等效劑量為15～30 mg/kg，故以30 mg/kg為本實驗的冰片常用劑量。根據我們前期研究，AST IV在大鼠以40 mg/kg劑量單獨應用及與PNS配伍時具有抗腦缺血再灌注損傷的作用，故以40 mg/kg為本實驗AST Ⅳ的常用劑量;PNS在大鼠以100～120 mg/kg單用及與AST Ⅳ配伍時，具有抗腦缺血作用，故以100 mg/kg為本實驗PNS的常用劑量。以常用劑量為中點，采用基線等比設計方法，每個藥物設計6個劑量水平，藥物劑量以50%遞增或遞減。見表1。

采用U6*（64）均勻設計實驗，根據表1設定的6個劑量水平，得到3種藥物6個不同的配伍實驗組。見表2。

另設模型組、假手術組，共計8組。取SPF級SD大鼠，灌胃干預3 d，每天2次，2次給藥間隔時間12 h。于第3天干預后1 h制作大腦中動脈阻塞（middle cerebral artery occlusion， MCAO）缺血模型[6]，假手術組僅游離頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈，不做結扎、插線處理，其他操作同其它組。缺血2 h后進行再灌注，再灌注期間繼續給藥。假手術組和模型組灌胃等容量0.5%羧甲基纖維素鈉。于再灌注后24 h進行相應指標檢測。

1.2.2? 神經功能學評分? 大鼠再灌注24 h后，參考文獻[6]對動物的神經功能進行評分。

1.2.3? 腦梗死率測定? 于再灌注24 h后，麻醉處死大鼠，迅速取腦。置-20 ℃冰箱15 min，去除小腦、腦干等，沿冠狀面將腦組織連續切片5片，每片厚2 mm，立即將切片放入2% TTC磷酸緩沖液中，置37 ℃水浴避光染色20 min，每5分鐘將腦片輕輕翻動1次。染色后置于4%多聚甲醛溶液中固定，24 h后將每片腦組織拍照。用Image-pro plus 6.0圖像分析軟件測量梗死灶面積。根據公式

V=t（A1+A2……+An）/全腦體積

計算梗死灶體積，再進一步計算梗死灶體積占全腦體積的百分比即為腦梗死率。其中t為切片厚度，A為梗死面積。

1.2.4? 腦水腫率測定? 計算出梗死灶體積和/全腦體積后，根據文獻[16]計算腦水腫率

S=（∑LT-∑RT）/（∑LT+∑RT）×100%

∑LT代表大腦左側半球總體積，∑RT代表大腦右側半球總體積。兩側大腦半球體積也由TTC染色結果可得。

1.2.5? 腦組織病理形態測定? 將腦組織放入4%多聚甲醛中固定2～3 d，經視交叉平面冠狀切片，經梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，切成4 μm的切片，用于HE染色。將切片在顯微鏡（10×40）下隨機取缺血側皮質區的5個非重疊視野對損傷細胞進行觀察，損傷細胞表現為空泡樣變性、嗜酸性樣變性、核固縮、核溶解等改變。分別計數每個高倍視野中的細胞總數及損傷細胞數。取5個視野的平均值作為該樣本的細胞損傷率。

細胞損傷率=（損傷細胞數/細胞總數）×100%

1.2.6? 伊文思藍（Evans blue， EB）法測定血腦屏障通透性? 于動物處死前30 min用10%水合氯醛麻醉，經股靜脈注入2%EB生理鹽水溶液（2 mL/kg）。30 min后放血處死大鼠，立即斷頸取腦，濾紙吸干組織表面水分，小心剝取兩側大腦半球，按EB試劑盒說明書進行吸光度測定，根據EB標準曲線，計算腦組織EB漏出量（μg/g腦組織），以此反映BBB受損情況。

1.3? 驗證實驗

根據均勻設計實驗得出冰片、AST Ⅳ、PNS配伍的有效配伍劑量（冰片7.5 mg/kg，AST Ⅳ 10 mg/kg，PNS 25 mg/kg），將動物隨機分為：假手術組、模型組、冰片7.5 mg/kg組、AST Ⅳ 10 mg/kg組、PNS 25 mg/kg組、AST Ⅳ 10 mg/kg+PNS 25 mg/kg組、冰片7.5 mg/kg+AST Ⅳ 10 mg/kg+PNS 25 mg/kg低劑量配伍組、冰片15 mg/kg+AST Ⅳ 20 mg/kg+PNS 50 mg/kg高劑量配伍組，以及依達拉奉4 mg/kg組，每組5只。灌胃干預3 d，每日2次，兩次間隔時間12 h，于第3天給藥后1 h同“1.2.1”制作MCAO模型。缺血2 h后進行再灌注，再灌注期間繼續給藥。于再灌注后24 h進行神經功能學評分及腦梗死率測定，方法同“1.2.2”及“1.2.3”。

1.4? 統計方法

實驗數據用“x±s”表示，采用SPSS 20.0統計軟件分析。各組計量資料比較用單因素方差分析，組間兩兩比較方差齊者用LSD檢驗，方差不齊者用Dunnet T3檢驗。P<0.05為差異具有統計學意義。均勻設計實驗的二次回歸分析，首先對各個效應指標進行多重線性回歸分析，再將各效應指標賦予不同權重，計算其綜合效應，同樣采用均勻設計實驗多重線性回歸分析方法分析，明確三種藥物配伍抗腦缺血再灌注損傷的有效配伍劑量。

2 結果

2.1? 均勻設計實驗分析

與假手術組比較，模型組神經功能評分、腦梗死率、腦水腫率、細胞損傷率、EB漏出量均顯著增加（P<0.01），表明腦缺血再灌注后神經細胞損傷，腦含水量增多，BBB受損，出現神經功能缺損癥狀。與模型組比較，第1～5組能顯著減少腦組織EB漏出量（P<0.01），且第5配伍組還能顯著降低神經功能評分、腦梗死率、腦水腫率，差異均具有統計學意義（P<0.01）。見表3。

將實驗藥物配比方案及以上的實驗結果進行多重線性回歸分析（回歸方程中設定X1為冰片，X2為AST Ⅳ，X3為PNS，Y為各組各指標的數據），結果如下。

2.1.1? 神經功能評分? 多重線性回歸分析為

Y=2.072+0.002X2

由于要求神經功能評分（Y值）越小越好，故冰片、AST Ⅳ、PNS均應取實驗范圍內的最小值，即冰片7.5 mg/kg、AST Ⅳ10 mg/kg、PNS25 mg/kg。

2.1.2? 腦梗死率? 白色區為梗死灶，紅色區為正常腦組織。假手術組腦組織未見蒼白梗死區，模型組出現較大范圍的蒼白梗死灶，各藥物組梗死體積均有不同程度減少，見圖1。多重線性回歸分析為

Y=18.039+0.21X1+0.117X2+0.044X3

由于要求腦梗死率（Y值）越小越好，故冰片、AST Ⅳ、PNS均應取實驗范圍內的最小值，即冰片7.5 mg/kg、AST Ⅳ10 mg/kg、PNS25 mg/kg。

2.1.3? 腦水腫率? 多重線性回歸方程為

Y=4.819+0.29X1+0.45X2+0.3X3

由于要求腦水腫率（Y值）越小越好，故冰片、AST Ⅳ、PNS均應取實驗范圍內的最小值，即冰片7.5 mg/kg、AST Ⅳ10 mg/kg、PNS25 mg/kg。

2.1.4? 細胞損傷率? 假手術組大腦皮質區細胞結構完整，形態規則，排列緊密。模型組腦組織細胞周圍間隙增大，胞核不規整，間質水腫明顯，排列紊亂，細胞核深染固縮或出現嗜酸性樣變性，損傷細胞增多，各給藥組細胞損傷程度有所減輕，見圖2。多重線性回歸方程為

Y=84.538-0.12X1+0.026X2-0.038X3

由于要求細胞損傷率（Y值）越小越好，故冰片、PNS應取實驗范圍內的最大值，AST Ⅳ取最小值，即冰片120 mg/kg、AST Ⅳ10 mg/kg、PNS400 mg/kg。

2.1.5? EB漏出量? 多重線性回歸方程為

Y=0.72+0.02X1+0.01X2

由于要求EB漏出量（Y值）越小越好，故冰片、AST Ⅳ、PNS均應取實驗范圍內的最小值，即冰片7.5 mg/kg、AST Ⅳ10 mg/kg、PNS25 mg/kg。

2.1.6? 各指標綜合加權評分的多重線性回歸分析? 在5個指標單獨分析的基礎上進行綜合分析，對每個指標賦予不同的權重，總權重為1，每個指標的平均權重系數為0.20。根據各指標的特異性和對腦損傷評價的重要性對每個指標賦予不同的權重。腦梗死率是直接評價腦組織損傷的指標，其特異性高;神經細胞損傷率是在微觀上評價神經細胞損傷的指標，也具有特異性高和直觀的特點。因此，將腦梗死率和神經細胞損傷率兩個指標在平均權重系數的基礎上各增加50%，即腦梗死率和細胞損傷率權重系數均為0.3。腦水腫率是評價腦缺血后腦水腫程度的指標，但由于本實驗的腦水腫率是根據腦梗死率來間接計算的，因此，腦水腫率的權重系數在平均權重系數的基礎上減少25%，即為0.15;EB漏出率是評價BBB受損的指標，但測定EB漏出率時受血管和血流狀態等的影響，是間接評價BBB受損程度的指標，因此，其權重系數也是在平均權重系數的基礎上減少25%，即為0.15。神經功能評分在一定程度上反映了神經功能缺損情況，該指標雖然在一定程度上可反映腦組織受損，但受機體狀態和代償功能等的影響，故權重系數是在平均權重系數的基礎上減少50%，即為0.10。將各指標的平均值×權重系數得到每項指標的權重得分，將各項指標的權重得分相加得到權重總分，再進行分析，見表3。將實驗藥物配比方案及其對應的實驗結果進行多重線性回歸分析，得回歸方程為

Y=4.446+0.007X2+0.000 005X3

由于要求權重總分（Y值）越小越好，故冰片、AST Ⅳ、PNS均應取實驗范圍內的最小值，即冰片7.5 mg/kg、AST Ⅳ10 mg/kg、PNS25 mg/kg。

2.2? 驗證實驗

假手術組大鼠無神經缺損癥狀。與假手術組比較，模型組神經功能評分顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，3種藥物配伍低、高劑量組及依達拉奉組神經功能評分顯著降低（P<0.05或P<0.01），且3種藥物配伍低劑量組的效應顯著優于各藥物單用組（P<0.05）。見圖3。

腦梗死率比較表明，假手術組無梗死灶形成，腦梗死率為0。與假手術組比較，模型組腦梗死率顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，冰片組，AST Ⅳ+PNS配伍組，3種藥物配伍高、低劑量組及陽性藥物依達拉奉組腦梗死率顯著縮小（P<0.05或P<0.01），且AST Ⅳ+PNS配伍組的效應強于AST Ⅳ單用組（P<0.05），3種藥物配伍低劑量組效應強于各藥物單用組及AST Ⅳ+PNS配伍組（P<0.05或P<0.01）。見圖4-5。

3 討論

冰片口服后可經胃腸道迅速吸收，廣泛分布于心、肺、脾臟，且極易透過血腦屏障進入腦組織。冰片及其配伍抗腦缺血的作用主要反映在兩個方面：一是冰片單用具有一定的抗腦缺血作用，能減少腦缺血再灌注模型的腦梗死體積[17]，抑制大鼠腦缺血再灌注急性期炎癥損傷[18]，抑制氧化應激損傷和細胞凋亡[19]。但冰片單用抗腦缺血的作用不強，常常作為佐使藥與其它藥物配伍使用，通過促進藥物吸收和進入病變部位，發揮協同增效作用。在抗腦缺血方面，研究表明，冰片配伍麝香可改善腦缺血動物血腦屏障通透性，減少腦梗死體積，抑制缺血后腦組織的炎癥反應[20];冰片及丹參三七配伍后可通過促進血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）的表達發揮腦保護作用[21]。因此，以冰片配伍其它藥物，可促進藥物吸收和進入病變腦組織，增強藥物的抗腦缺血作用。

本研究采用均勻設計實驗，研究表明，腦缺血2 h再灌注24 h后，大鼠出現神經功能障礙，腦梗死體積增大，腦含水量、神經細胞損傷率增加，血腦屏障受損嚴重，呈現明顯的腦組織損傷。冰片、ASTⅣ、PNS不同劑量配伍可在一定程度上降低神經功能評分，減輕神經功能缺損癥狀，縮小腦梗死體積、降低腦含水量、神經細胞損傷率，減輕血腦屏障受損。各指標綜合加權計分的多重線性回歸分析表明，冰片7.5 mg/kg、AST Ⅳ10 mg/kg、PNS 25 mg/kg配伍具有較好的抗腦缺血再灌注損傷作用，為三者抗腦缺血再灌注損傷的有效配伍劑量。驗證實驗結果顯示，3種藥物配伍的高、低劑量均能能顯著降低大鼠神經功能評分，且3種藥物低劑量配伍的效應顯著優于各藥物單用，表明冰片、AST Ⅳ、PNS配伍可增強對腦缺血再灌注后神經功能缺損障礙的改善作用;同時，冰片、AST Ⅳ+PNS配伍，3種藥物高、低劑量配伍能顯著降低腦梗死率，3種藥物低劑量配伍效應強于各藥物單用及AST Ⅳ+PNS配伍，也表明冰片、AST Ⅳ、PNS配伍對減輕腦缺血再灌注后腦組織損傷具有增效作用。至于冰片是否是通過促進AST Ⅳ和PNS透過血腦屏障發揮協同增效作用，以及入腦后的具體作用機制如何，尚待我們進一步研究。

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