電壓門控氯通道3可促進膠質瘤細胞的侵襲和遷移

王兵 廖勇仕 謝娟 鄧杰 陳平 郭英

【關鍵詞】 膠質瘤;電壓門控氯通道3;侵襲; 遷移

Chloride channel-3 promotes invasion and migration of glioma cells Wang Bing， Liao Yongshi， Xie Juan， Deng Jie， Chen Ping， Guo Ying. Department of Neurosurgery， the Second Hospital， University of South China， Hengyang 421001， China

【Abstract】 Objective To investigate the expression and effect of chloride channel-3 （CLC-3） on the invasion and migration of human glioma cells. ?Methods Immunohistochemical staining was adopted to detect the expression of CLC-3 protein in the pathological sections of 30 glioma patients with complete data and brain specimens from 6 non-glioma normal subjects. The expression of CLC-3 in the U87MG cell lines was down-regulated by ShCLC-3 interfering adenovirus. The invasion and migration of glioma cells were detected by Transwell invasion and migration assay. The detection results were statistically analyzed. ?Results According to the pathological grading criteria of glioma by WHO， 6 cases were classified as grade Ⅰ， 9 cases of gradeⅡ， 7 cases of grade Ⅲ and 8 cases of grade Ⅳ. CLC-3 was stained as yellow or brown in the high-grade glioma （grade Ⅲ-Ⅳ）， light yellow or yellow in the low-grade glioma （grade Ⅰ-Ⅱ）. In the normal brain cells， CLC-3 was not stained in 1 case， and light yellow in the remaining 5 cases. The expression of CLC-3 protein was not significantly correlated with gender or age （both P > 0.05）. Spearman rank correlation analysis demonstrated that the expression of CLC-3 was positively correlated with WHO pathological grading of glioma （rs = 0.782， P < 0.001）. The expression of CLC-3 was significantly down-regulated in U87MG cells after the cells were infected by the ShCLC-3 adenovirus， and the invasion and migration abilities of glioma cells were significantly reduced （both P < 0.05）. ?Conclusions CLC-3 is highly expressed in the pathological specimens of glioma， which is positively correlated with pathological grading of glioma. CLC-3 can promote the invasion and migration of glioma cells.

【Key words】 Glioma;Chloride channel-3;Invasion;Migration

膠質瘤是中樞神經系統中最常見的和高侵襲性的原發性惡性腫瘤，即使聯合手術、放射治療和化學治療等綜合治療，膠質瘤患者的預后仍然很差。惡性程度最高的膠質母細胞瘤（GBM）的中位生存期為12 ～ 15個月[1]。導致膠質瘤患者預后不良的主要原因是其高度侵襲性，目前分子機制仍未清楚[2]。最近的研究表明離子通道在腫瘤的惡性生物學行為中發揮了重要作用。電壓門控氯通道3（CLC-3）是CLC家族的成員之一，被認為是容積調節性氯通道的重要組分部分，廣泛參與細胞容積調節、細胞增殖、細胞凋亡、細胞遷移、炎癥反應等多種病理生理過程[3-5]。CLC-3在鼻咽癌、宮頸癌等多種腫瘤中的作用已被證實[6]。近年來有關膠質瘤與CLC-3的研究亦有報道，但CLC-3在不同病理級別膠質瘤中的表達及作用仍未明確。在本研究中，筆者通過檢測30例不同病理級別膠質瘤標本中CLC-3的表達，以及分析短發夾靶向人CLC-3序列（ShCLC-3）干擾腺病毒下調膠質瘤細胞株CLC-3表達后膠質瘤細胞侵襲遷移情況，以明確CLC-3在不同級別膠質瘤中的表達及CLC-3在膠質瘤侵襲遷移中的作用，以期為CLC-3作為膠質瘤治療的靶標提供理論基礎。

材料與方法

一、主要試劑

CLC-3單抗（英國Abcam公司）、膠質瘤細胞系U87MG和SNB19（ATCC， Microbix公司）、生物素化羊抗兔二抗（美國Vector Laboratories）、SP法免疫組化試劑盒（中國中衫金橋）、DAB顯色試劑（美國DAKO公司）、50×EDTA修復液（美國DAKO公司）、Triton-Xl（北京泰澤瑞達公司）、蘇木素染色劑（美國DACO公司）、檸檬酸抗原修復工作液（北京中衫金橋公司）、Trizol試劑（美國Invitrogen公司）、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、BGA蛋白濃度測定試劑盒（中國碧云天）、PVDF膜（美國Pierce公司）、ECL（美國Pierce公司）、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（中國碧云天）、考馬斯亮藍快速染色液（中國碧云天）0.1 % Fibronectin（美國Sigma公司）、BSA（美國Amresco公司）、RPMI1640（美國HyClone公司）、HEPES（美國Sigma公司）、胎牛血清（美國HyClone公司）、PVDF膜（美國Pierce公司）Transwell小室（膜）（美國，Transwell）。

二、材 料

選取于中山大學附屬第三醫院神經外科通過手術切除的30例臨床及病理資料完整的膠質瘤患者的石蠟包埋標本，其中男19例、女11例，年齡（52.0±13.6）歲。所有患者術前未接受任何放射或化學治療。按WHO膠質瘤病理分級標準進行分級：Ⅰ級6例（毛細胞型星形細胞瘤）、Ⅱ級9例（彌漫型星形細胞瘤）、Ⅲ級7例（間變型星形細胞瘤）、Ⅳ級8例（原發性膠質母細胞瘤）。另選取于中山大學附屬第三醫院因外傷或出血行開顱手術的6例患者的正常腦組織標本（由手術入路獲得）作為對照。膠質瘤組織和對照組織經10%甲醛固定，常規石蠟包埋，連續切片，制成4 mm

厚片備染。所有標本行蘇木素-伊紅染色（HE染色）確認后行免疫組織化學（免疫組化）檢測。所有標本均經2位病理科醫師檢測確診。本研究獲得中山大學附屬第三醫院倫理委員會的批準。

三、免疫組化

使用標準鏈霉抗生物素蛋白-過氧化物酶復合物方法進行免疫組化染色。染色結果通過顯微鏡觀察10個高倍鏡視野，根據表達陽性細胞數量及著色深淺判斷染色強度，染色強度評分：無著色為0，淡黃色為1，棕黃色為2，棕褐色為3;陽性細胞比例評分陰性為0分，≤25%為1分，26% ～ 50%為2分，51% ～ 75%為3分，≥76%為4分。每例細胞染色積分=染色強度評分+陽性細胞比例評分。按照積分分值可將表達程度分為：陰性（-）0 ～ 1分;弱陽性（+）2分;中度陽性（++）3 ～ 4分;強陽性（+++）5 ～ 7分。弱陽性、中度陽性及強陽性表達合稱為陽性表達。結果由2位病理科醫師獨立評估確認。

四、細胞培養

膠質瘤細胞株U87MG在含5%胎牛血清的RPMI1640培養基中，于5%二氧化碳、37℃培養箱培養1周，傳代2 ～ 3代。

五、沉默CLC-3表達腺病毒ShCLC-3的構建

ShCLC-3（NM_00124 3374.1）為5’-CCACGACUGGUUUAUCUUUCUCAAGAGAAAAGAUAAACCAGUCGUGG-3’。對照加擾序列為5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUUUCAAGAGAACGUGACACGUUCGGAGAA-3’。通過使用AdEasy系統（MP Biomedicals Inc.）產生高滴度的重組腺病毒感染膠質瘤細胞株U87MG以敲低CLC-3的表達并通過蛋白免疫印跡檢測構建效果。

六、Transwell細胞遷移和侵襲實驗

將胎牛血清培養基中的細胞（2×104）添加在BioCoatTM侵襲室（BD）的上室中（分為腺病毒干擾CLC-3組及空病毒載體組），并在37℃孵育20 h，隨后除去細胞內的細胞上部室與棉花棒。用甲醇固定在膜底部表面上遷移和侵入的細胞，用1%結晶紫染色并使用光學顯微鏡在放大倍數×100的5個隨機視野中計數。遷移實驗過程與侵襲實驗過程基本一致，不同的只是上室不需要鋪以Matrigel膠。

七、統計學處理

采用SPSS 19.0處理數據，正態分布計量資料用表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗;等級資料用率表示，多組間比較用秩和檢驗;CLC-3的表達強度與WHO膠質瘤病理分級間的相關性采用Spearman秩相關分析。P < 0.05為差異具有統計學意義。

結 果

一、CLC-3在膠質瘤組織中的表達及與WHO膠質瘤病理分級的關系

高級別（Ⅲ ～ Ⅳ級）膠質瘤細胞的染色呈明顯棕黃色或棕褐色，提示CLC-3高表達;低級別（Ⅰ ～ Ⅱ）膠質瘤細胞呈淡黃色或棕黃色，提示CLC-3低表達;正常腦細胞1例無著色，另外5例呈淡黃色，提示在正常腦細胞中CLC-3也呈低表達。在膠質瘤細胞中，CLC-3表達產物主要位于細胞膜和細胞漿，在細胞核亦可見陽性染色，見圖1、表1。

上述結果提示CLC-3在膠質瘤細胞中高表達，進一步對CLC-3的表達量與不同WHO膠質瘤病理分級的相關性進行研究，CLC-3在不同級別膠質瘤細胞中的表達強度差異具有統計學意義（P < 0.001），見表2。進一步行Spearman秩相關分析結果顯示CLC-3的表達與WHO膠質瘤病理分級呈正相關（rs= 0.782 、P < 0.001）。

二、抑制CLC-3表達對膠質瘤U87MG細胞的侵襲和遷移能力的影響

1. ShCLC-3腺病毒載體對膠質瘤細胞株U87-MG中CLC-3表達的影響

ShCLC-3腺病毒可明顯抑制膠質瘤細胞株U87MG中CLC-3蛋白的表達水平，見圖2。

2. 抑制CLC-3表達對膠質瘤細胞株U87MG侵襲和遷移能力的影響

抑制CLC-3表達后，通過Transwell 小室的細胞數量明顯減少。進一步行細胞計數，空病毒載體組與腺病毒干擾CLC-3組侵襲和遷移細胞數量差異均有統計學意義（n = 6，t分別為20.684、24.245，P均< 0.05）。提示抑制CLC-3表達后膠質瘤U87MG細胞的侵襲和遷移能力減弱，見圖3。

討 論

CLC-3已被證實在多種實體腫瘤細胞中高表達，并與腫瘤的侵襲性相關。我們的研究表明CLC-3在膠質瘤中高表達，并與其病理分級呈正相關;抑制CLC-3的表達可使膠質瘤細胞株的侵襲和遷移能力減弱，提示CLC-3或可作為治療膠質瘤的一種潛在靶標。

膠質瘤的生長與其他實體腫瘤不同，腫瘤細胞在顱內受限空間內沿腦組織間隙侵襲性生長，而瘤周是低滲水腫環境，暴露于這種低滲水腫環境下的細胞如果不能主動調節容積改變，就會發生持續性膨脹，表現出生長抑制，甚至發生細胞凋亡[7-8]。這些環境特點需要膠質瘤較其他實體腫瘤具有更強的細胞容積調節能力及形變能力。研究證實低滲環境下，星形膠質細胞僅可實現容積的部分恢復，而膠質瘤細胞可調節細胞恢復原有的甚至更小的容積[9]。原位圖像顯示侵襲的膠質瘤細胞通常呈現細長的紡錘形形態黏附于血管上[10]。細胞對容積的調節是通過細胞膜上離子通道和離子交換體來實現的[11]。作為細胞內、外液中最主要的陰離子，氯離子被認為是參與調節性細胞容積回縮過程的主要溶質，大多數細胞膨脹會導致氯通道的活化[12-13]。CLC-3，一種電壓依賴性氯離子通道，主要分布于中樞神經系統，在膠質瘤細胞容積調節過程中發揮重要作用。臨床中我們常看到膠質瘤瘤周水腫隨著病理級別的升高而明顯加重，低級別膠質瘤瘤周無明顯水腫或僅有輕度水腫，高級別膠質瘤尤其是膠質母細胞瘤瘤周水腫非常明顯。在低滲水腫環境下，膠質瘤細胞表現出很強的增殖和侵襲能力，其機制目前仍未清楚。我們的研究顯示CLC-3在膠質瘤中高表達，高表達的CLC-3主要分布在細胞膜上，且與WHO膠質瘤病理分級呈正相關，高表達的CLC-3可促進膠質瘤的侵襲和遷移，提示CLC-3在其中發揮了重要作用，瘤周低滲水腫環境下的細胞膨脹可能是膠質瘤細胞CLC-3激活和高表達的啟動因子。

CLC-3促進膠質瘤細胞侵襲和遷移的機制目前尚未清楚。研究表明CLC-3可通過調節細胞體積在細胞遷移和侵襲中起關鍵作用[6]。CLC-3介導氯離子的分泌以及水的排出，以實現細胞體積改變和形狀適應，促進膠質瘤細胞侵入狹窄和曲折的細胞外空間。有研究顯示，在膠質瘤細胞系和膠質瘤患者樣本中，細胞膜上的CLC-3蛋白均上調[14]。CLC-3與大電導鈣激活性鉀通道（BK通道）共定位于膠質瘤細胞，BK通道是神經膠質瘤細胞鉀離子流出的主要途徑，其激活是膠質瘤遷移所必需的[10， 15]。這種共定位表明膠質瘤細胞協調的離子通道動態調節前導過程，促進細胞入侵。臨床上常見的腫瘤周圍腦水腫隨著膠質瘤病理分級的增加而明顯增加[16]。研究顯示腫瘤周圍腦水腫是影響膠質瘤發病率和病死率的重要原因[17]。目前仍缺乏合理的機制解釋，我們的研究結果提供了一種新的分子機制解釋。

綜上所述，CLC-3在膠質瘤的侵襲遷移中發揮了重要作用，但其機制目前仍未清楚，是否僅通過調節細胞容積促進膠質瘤細胞侵襲和遷移，還是存在其他途徑，我們的課題組將行進一步研究。

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（收稿日期：2019-01-11）

（本文編輯：洪悅民）