基于代謝組學探討強直性脊柱炎的環境危險因素

歐嘉勇 吳嘉玲 魏秋靜 古潔若

【關鍵詞】 強直性脊柱炎;代謝組學;外源性代謝物;環境因素;超高效液相色譜-質譜

Evaluation of environmental risk factors of ankylosing spondylitis based on metabolomics Ou Jiayong，

Wu Jialing， Wei Qiujing， Gu Jieruo. Department of Rheumatology， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China

Corresponding author， Gu Jieruo， E-mail： gujieruo@ 163. com

【Abstract】 Objective To identify the environmental risk factors of ankylosing spondylitis （AS） by comparing the serum exogenous metabolites between AS patients and healthy controls. ?Methods Ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry （UPLC-MS） was applied to detect the serum metabolic profiles in 49 AS patients and 28 healthy controls. Random forest （RF） model combined with univariate statistical analysis were utilized to identify the differential metabolites between two groups. The characteristics of exogenous metabolites and their correlation with C reactive protein （CRP） and erythrocyte sedimentation rate （ESR） were studied. ?Results Lowretention time deviation of each sample suggested that the detection process was stable. The overall prediction error rate was 0.143， indicating that the RF model was successfully established. After the combination with univariate statistical analysis， 10 exogenous metabolites with an adjusted error detection rate < 0.5 were obtained. The normalized peak intensities of any two of diethofencarb， Avenanthramidea and dibenzofuran were significantly correlated （all r > 0.95，all P < 0.01）. The normalized peak intensities of dibenzofuran， Avenanthramide a， BAXGP and diethofencarb were positively correlated with CRP and ESR （all P < 0.05）. ?Conclusions Serum metabolomics can reflect the environmental risk factors of AS to certain extent. The exogenous metabolites might be associated with the severity of AS.

【Key words】 Ankylosing spondylitis;Metabolomics;Exogenous metabolite;Environmental factor;

Ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry

強直性脊柱炎（AS）是一種累及中軸關節為主，可伴有葡萄膜炎、起止點炎、銀屑病、炎癥性腸病等外周表現的自身炎癥性疾病。AS病因尚不明確，目前認為與HLA-B27相關，并受環境影響[1]。代謝組學主要是研究生物體中某種體液在受到長期外源性刺激或基因修飾后機體內代謝物的變化[2]。目前有關AS的代謝組學特點在國內尚未見報道。為此，本研究采用超高效液相色譜-質譜（UPLC-MS）檢測AS患者及健康志愿者（HC）的血清代謝組學差異，研究外源性差異代謝物的特點，探討與AS相關的環境危險因素。

對象與方法

一、研究對象

選擇2014年1月至2017年7月在我科就診的49例AS患者為AS組。該49例均符合以下標準：①1984改良的AS紐約診斷標準;②年齡大于18歲;③未接受過TNF-α阻斷劑治療;④排除其他類型風濕病及全身代謝性疾病。其中男39例、女10例，年齡29（18，53）歲，病程

6.0（0.1，24.0）年，CRP（1.03±0.21）mg/L，ESR

（20.77±7.84）mm/h，Bath AS疾病活動度指數（BASDAI）3.0（0，6.9），HLA-B27陽性47例。另

選擇年齡大于18歲、排除脊柱關節病或其他類型風濕病及全身代謝性疾病的28名HC為對照組。AS組與HC組的性別、年齡及BMI比較差異均無統計學意義（P均> 0.05）。本研究經中山大學附屬第三醫院醫學倫理委員會批準，并征得所有受試者的知情同意。

二、方 法

1. 主要試劑及儀器

乙腈、甲醇及超純水購自德國默克公司，甲酸購自上海CNW公司，2-氯苯丙氨酸購自GL 生化（上海）有限公司。液相色譜-質譜（LC-MS）分析采用賽默飛世爾科技Orbitrap EliteTM 組合型離子阱Orbitrap質譜儀及HypersilTM BDS C18 色譜柱（長100 mm，直徑2.1mm，粒徑1.9 μm）。

2. 樣品制備

于清晨采集受試者的外周血，分離血清，置于-80 ℃保存。使用前將血清樣本置于室溫解凍，取100 μl血清樣本加入300 μl甲醇以沉淀血清中蛋白，并加入10 μl內標（2.9 mg/ml，2-氯苯丙氨

酸），渦旋混勻30 s，置于4 ℃離心機中，12 000 ×g離心15 min。吸取200 μl上清液，轉入進樣小瓶檢測。

3. UPLC-MS檢測

取制備好的樣品進行UPLC-MS檢測。首先進行流動相洗脫，色譜分離條件：柱溫40 ℃，流速0.3 ml/min，流動相A為水、0.1%甲酸，流動相B為乙腈、0.1%甲酸。自動進樣器溫度4 ℃。質譜檢測參數：正模式時的加熱器溫度300 ℃，鞘氣流速45 arb，輔助氣流速15 arb，尾氣流速1 arb，電噴霧電壓3.0 kV，毛細管溫度350℃，S-棱鏡射頻分數為30%;負模式時的加熱器溫度300 ℃，鞘氣流速45 arb，輔助氣流速15 arb，尾氣流速1 arb電噴霧電壓3.2 KV，毛細管溫度350℃，S-棱鏡射頻分數為60%。

三、統計學處理

使用XCMS R包繪制保留時間vs.保留時間變異程度曲線對讀取前數據進行穩定性評價，利用Compoud Discoverer軟件對LC-MS檢測數據進行提取，整理成二維數據矩陣形式，包含保留時間、分子量、觀察量（樣本名稱）、可提取物質個數和峰強度等信息;將原數始據進行峰強度歸一化、標準化，根據質量控制樣本計算每個特征峰的相對標準偏差（RSD），應用Metaboanalyst 4.0的隨機森林分類算法，將AS組與HC組設為預測終點，決策樹數目為500，將所有代謝物放入模型中，運行模型算法，對RSD < 30%并且能與數據庫匹配的特征峰構建隨機森林模型及進行單變量統計分析。差異物質篩選標準：按分類精度的貢獻度對特征峰進行排序，貢獻度大于0，并且單變量統計分析校正后錯誤發現率（FDR）< 0.5。FDR為根據數據類型進行組間參數檢驗（t檢驗）或非參數檢驗（秩和檢驗）后得到P值并進行校正后所得。2組間峰強度倍數變化（FC）=AS均數/HC均數。使用人類代謝組學數據庫檢索并確定代謝物來源。正態分布的計量資料以表示，非正態分布的計量資料以中位數（上、下四分位數）表示。采用Pearson相關分析差異代謝物與CRP和ESR以及差異代謝物標準化峰強度之間的相關性。所有統計分析采用SPSS 20.0和R 3.5.1。

結 果

一、代謝組學檢測的質量評價

保留時間vs.保留時間變異程度曲線顯示，每例樣本在代謝物檢測過程中系統波動，整體而言，各例樣本保留時間曲線基本相似，未見變異特別大的曲線，即沒有離群樣本;單例樣本的保留時間變異基本沒有超過0.1，每例樣本在檢測過程當中也基本穩定，提示UPLC-MS檢測系統是穩定、可靠的，見圖1。

二、隨機森林模型的建立及外源性差異物質的鑒定

決策樹數目到150 ～ 200時，模型趨于穩定，見圖2，AS與HC能明確地分成2組，總體預測錯誤率為0.143，處于較低水平，模型建立成功。根據特征峰的分類精度貢獻度，結合單變量統計分析，得到模型中重要分類代謝物中的10個外源性代謝物，見表1，外源性代謝物來源多樣，某些可能是潛在的毒性物質。各種差異外源性物質在AS組與HC組的數據分布散點圖見圖3。相關性分析顯示，乙霉威、Avenanthramide a及二苯并呋喃三者的峰強度兩兩高度相關（r均> 0.95，P均< 0.01），見圖4。

三、外源性代謝物與炎癥指標的相關性分析

二苯并呋喃、Avenanthramide a、BAXGP、乙霉威的標準化峰強度與CRP及ESR均呈正相關（P均< 0.05），見表2。

討 論

AS是一種與HLA-B27密切相關的自身炎癥性疾病，但其發病不能完全從基因的角度進行解釋[3-4]。研究表明，嬰兒期的非母乳喂養方式及童年時因呼吸道感染住院等均可能增加成年后發展為AS的風險[5-6]。在疾病模型研究中發現，無菌的HLA-B27轉基因小鼠不會發生AS關節炎的表現[7]。由此表明，環境因素可能作為一個觸發因素參與到AS的發病或疾病進展當中。本研究嘗試通過探討AS患者與健康人群在血清代謝組學中的區別，從外源性差異代謝物的特點及來源分析AS患者潛在的環境危險因素。隨機森林模型結果顯示，AS患者的血清代謝組學輪廓與健康人群區分明顯;差異代謝物中有10種為外源性代謝物，其來源不盡相同。

本研究中，AS患者血清中谷物類食物的標記物Avenanthramide a升高，并與CRP及ESR呈正相關。Cao等[8]的研究表明，長期的高糖型膳食結構可以引起腸黏膜ATP水平升高，引起炎癥因子IL-17的表達增加;而且有趣的是，農藥成分乙霉威、防腐劑對羥基苯甲酸丁酯及二苯并呋喃在患者血清中也升高，且谷類標記物Avenanthramide a與這些毒素具有較高的相關性，這說明潛在的毒性物質可能是隨著長期的谷類物質的進食而進入患者體內。二苯并呋喃、乙霉威與CRP和ESR也呈正相關，可能是因為毒性物質在數據上與Avenanthramide a呈現共線性的結果。另有研究表明，腸道菌群參與到AS的發病及疾病進展AS患者往往伴發無臨床癥狀的腸道炎癥[9-10]。上述均表明，AS患者的腸道環境與健康人群存在區別，其腸黏膜對各類毒素及食物的吸收能力可能發生改變。

吸煙是AS疾病活動度的獨立危險因素[11]。本研究中，煙草的2種代謝物2-氨基萘及金合歡醇丙酮在AS與健康人群之間存在差異，但并不與CRP或ESR相關，而且金合歡醇丙酮水平在AS患者體內下降，因此煙草代謝物對于AS患者的作用在本研究中并不明確，有待進一步探究。

多種茶葉來源的代謝物在AS患者血清中升高，BAXGP與ESR及CRP呈正相關。目前沒有茶葉成份與AS發病相關的報道。喝茶是一種令人放松的習慣，而AS患者可因疾病活動時的炎性腰背痛導致睡眠障礙，也可能導致一些抑郁情緒[12]。喝茶的過程所帶來的身心放松過程可能在一定程度上可以改善患者的情緒。今后我們將在流行病學進行相關的調查以驗證這一猜想。

綜上所述，本研究通過對代謝組學中外源性差異代謝物特點進行研究，得到一些與AS發病可能相關的環境危險因素，如高糖飲食、吸煙等，而這些代謝物也可能反映了患者獨特的環境接觸因素或生活習慣。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2019-01-31）

（本文編輯：林燕薇）