潔凈室沉降菌檢測采樣點高度影響考察研究

許菊

【摘 要】目的對潔凈室沉降菌監測中可能影響微生物生長的各種因素進行試驗分析，找出一種行之有效的操作方法。方法按《中國藥典》四部9205要求對潔凈室沉降菌進行監測。結果培養方式、培養基的量、沉碟暴露時間、沉降碟放置位置對最終監測結果均有一定影響。結論對潔凈室進行沉降菌監測時應綜合考慮各種因素的影響，以得到最客觀的監測結果。

【關鍵詞】潔凈室；沉降菌；影響因素

醫藥工業潔凈室（區）沉降菌的測試方法（G B/T 1 6 2 9 4一20 1 0）中規定，動態測試時，培養皿的暴露時間為不大于如，《藥品生產質量管理規范》G M（P 2 01O年修訂版）、歐盟EUC G M P、美國F D AC G M P中沉降菌的測試合格標準均以如為單位時間衡，但是均規定，培養皿暴露時間不得超過如，即考慮到培養皿隨著放置時間的延長其培養基會因為失水等原因影響微生物正常生長。

一、潔凈室的微生物檢測

近年修訂藥品生產質量管理規范（衛生部令第79號）附錄1中第十一條：應當對微生物數進行動態監測，評估無菌生產的微生物狀況。監測方法有沉降菌、定量空氣浮游菌、表面取樣法[2]。因為浮游菌監測需要浮游菌檢測儀，并且每次檢測前，還需將浮游菌檢測儀的采樣上蓋做滅菌處理，較沉降菌檢測方法繁瑣。因此，大多數藥品生產廠家在日常監測潔凈室空氣中的微生物時，因實際操作比較方便的沉降菌檢測法使用的頻率較高。

二、沉降菌的檢測

國內藥品企業沉降菌的日常檢測按G B/T l6294—2010《醫藥工業潔凈室（區）沉降菌的檢測方法》檢測，但潔凈室的平均菌落數必須低于所選定的評定標準。沉降菌檢測除操作方便外，又具有費用低、對空氣環境破壞小，特別是在具有層流的區域，不會干擾氣流的方向，因而在潔凈區的環境監測中應用廣泛，。

三、儀器、設備與材料

1.儀器。全自動數顯恒溫鼓風干燥箱；全自動數顯生化培養箱；全自動數顯立式蒸汽滅菌器；生物安全柜；滅菌刻度吸管、試管、Q 90 mm×15 mm培養皿等。

2.設備。標準潔凈室，T：18～26℃，RH：45%～65%。

3.培養基。胰酪大豆胨瓊脂培養基；胰酪大豆胨液體培養基；沙氏葡萄糖瓊脂培養基；沙氏葡萄糖瓊液體養基。所有制備好的培養基均照《中國藥典》2015年版（四部）1421“滅菌法”操作，在121℃滅菌20 min。

4.驗證試驗用菌種。金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）（10104）]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）（63501）]、白色念珠菌[CMCC（F）（98001）]、黑曲霉菌[CMCC（F）（98003）。所有實驗用菌種均為第三代。

四、方法

1.菌液制備。取經30～35℃培養18～24 h的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌與枯草芽孢桿菌的胰酪大豆胨液體培養基培養物1 mL分別加至9 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液中，10倍稀釋成相應濃度且含菌數小于100 cfu/mL的菌懸液備用。取經20～25℃培養2～3 d的白色念珠菌的沙氏葡萄糖液體培養基培養物1 mL，加入9 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液中，10倍稀釋至相應濃度且含菌數小于100 cfu/mL的菌懸液備用。取經20～25℃培養5～7 d的黑曲霉菌的沙氏葡萄糖瓊脂培養物，加2 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液，洗下孢子，轉移至另一空管，取1 mL加至9 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液中，10倍稀釋成相應濃度且含孢子數小于100 cfu/mL的孢子懸液備用。

2.方法驗證。培養基適用性檢查：每次均以兩個平皿在操作臺暴露4 h作為陰性對照。（1）培養基失重情況考察（單位：g）。①取制備好的胰酪大豆胨瓊脂培養基沉降碟（培養基量30 mL）先在30～35℃常規預培養48 h后在潔凈室動態環境下暴露4 h，再依法培養。②取制備好的胰酪大豆胨瓊脂培養基沉降碟（培養基量30 mL）以雙層透明無菌袋包裝燙封后先在30～35℃預培養48 h后，在潔凈室動態環境下暴露4 h，再依法培養。（2）培養基量對微生物生長的影響。依法制備胰酪大豆胨瓊脂培養基沉降碟45個（培養基加入量分別為：20、30、40 mL各15個），以雙層透明無菌袋包裝燙封后在30～35℃培養48 h，無菌生長。在潔凈室操作臺均勻放置，動態暴露4 h后，取不同培養基量的沉降碟分為5組分別接種。接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌菌液的，于30～35℃培養2 d；接種白色念珠菌、黑曲霉菌液的，于20～25℃培養5 d。點計菌落數，取平均值計算比值。（3）暴露時間對微生物生長的影響。依法制備胰酪大豆胨瓊脂培養基沉降碟60個（培養基加入量30 mL）以雙層透明無菌袋包裝燙封后在30～35℃培養48 h，無菌生長。分成4組，每組15個，在潔凈室操作臺均勻放置，動態暴露時間分布為1、2、3、4 h，取不同暴露時間的沉降碟分為5組分別接種。接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌菌液的，于30～35℃培養2 d；接種白色念珠菌、黑曲霉菌菌液的，于20～25℃培養5 d。點計菌落數，取平均值計算比值。結（4）培養方式對微生物生長的影響。①培養方式1：常規培養。依法制備胰酪大豆胨瓊脂培養基沉降碟15個（培養基加入量30 mL）以雙層透明無菌袋包裝燙封后在30～35℃培養48 h，無菌生長。在潔凈室操作臺均勻放置，動態暴露4 h后，分為5組分別接種。接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌菌液的，于30～35℃培養2 d；接種白色念珠菌、黑曲霉菌菌液的，于20～25℃培養5 d。點計菌落數，取平均值計算比值。

3.討論。（1）培養基失重情況考察。因為采用的沉降碟不是終端滅菌，制備好后要100%進行預培養。常規預培養后依法操作，培養基總失重平均占比情況（失重率%）。說明采用密封預培養能明顯減少預培養過程中的水分損失，同時在沉降菌監測中沉降碟不應放置于通風口附近。因為不同潔凈室或生產車間環境條件不一樣，受溫度濕度及層流的風速的影響，培養基失重數據會有一定波動。（2）培養基量干擾培養結果。培養基為20、30、40 mL驗證測得比值均在0.5～2范圍內。但培養基量以30～40 mL為宜；20 mL量較少，水份損失后對微生物生長有一定影響，例如銅綠假單胞菌，比值僅為0.59；實際操作時不可能采用量器加培養基，加量不會很精準，多于40 mL已接近培養皿上沿，操作不當可能導致培養基溢出，同時黑曲霉培養5 d后已生成較為豐富的菌絲，如接觸皿蓋，造成計數困難，且孢子一旦逸出則會導致嚴重的環境污染。

隨著我國藥品G M PS U度的發展，對藥品生產中潔凈室控制的要求越來越高，醫藥生產潔凈室屬于一般生物潔凈室，主要控制有生命的微粒兼塵埃微粒對產品的污染。藥廠應自覺按照G M P的要求，對潔凈區域制定系統的環境監測方案，以有代表性的、準確的數據評價環境的微生物分布情況，判定潔凈區環境是否處于良好的受控狀態下運行。要做到這些，正確的方法是關鍵性的。

參考文獻：

[1]毛小曉.現代醫藥工業微生物實驗室質量管理與驗證技術[M].中國協和醫科大學出版社.2014

[2]任毛.滅菌制劑室空氣中塵埃粒子測定試驗[J].西北藥學雜志，201，6（1）：22.

[3]潘小藝.現代醫藥工業微生物實驗室質量管理與驗證技術[M].中國協和醫科大學出版社.

[4]李麗.滅菌制劑室空氣中塵埃粒子測定試驗[J].西北藥學雜志，2014，6（1）：22.

（作者單位：天津津環醫凈空氣檢測技術有限公司）