振動式超微粉碎處理時間對白毛木耳多糖提取率及體外抗氧化性質的影響

邵家威 郝征紅 岳鳳麗 付建鑫 劉瑩 仇薈然

摘 要：利用振動式超微粉碎對白毛木耳進行處理，研究粉碎時間對多糖提取率及多糖抗氧化性的影響。超微粉碎3 min的白毛木耳粉，分別用熱水浸提法、索氏提取法、超聲微波聯用法提取多糖，得率分別為3.8%、4.7%、11.0%。對超微粉碎0～20 min的白毛木耳粉，用超聲微波聯用法提取多糖，發現超微粉碎20 min時多糖得率最高為48.0%。對不同超微粉碎時間制備的多糖進行抗氧化性質的研究，結果發現，超微粉碎20 min后提取的多糖對OH-自由基的清除率最高，達到29.4%;超微粉碎8 min后提取的多糖對DPPH自由基的清除率最高，達到79.7%;超微粉碎15 min后提取的多糖對O2-自由基的清除率最高，達到92.5%。振動式超微粉碎時間與白毛木耳多糖提取率呈正相關關系，對OH-自由基、DPPH自由基、O2-自由基的抗氧化性無正相關關系。

關鍵詞：振動超微粉碎;粉碎時間;白毛木耳;多糖;抗氧化

毛木耳屬于擔子菌綱木耳目木耳科木耳屬中的毛木耳種[1-2]。與黑木耳相比，毛木耳耳片大、厚、質地粗韌，且粗纖維[2]、蛋白質[3-5]、礦物質、維生素[6]、多糖[7-9]的含量較高。超微粉碎是指利用機械或流體動力的方法克服固體內部凝聚力使之破碎，從而使產品具有界面活性，呈現出特殊功能的過程[10]。本文使用的振動式藥物粉碎機應用于毛木耳精深加工領域，可以提高毛木耳口感，有利于營養物質吸收，提高資源利用率。目前，對于不同超微粉碎時間影響白毛木耳多糖得率以及體外抗氧化性質均未見研究。本文研究了不同超微粉碎時間對多糖提取得率的影響，并測定了白毛木耳多糖的體外抗氧化的能力，以期為毛木耳的深加工研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白毛木耳，山東濟寧市魚臺毛木耳種植基地;無水乙醇、H2SO4、HCl、CHCl3、正丁醇、NaOH、H2O2，分析純，天津市天力化學試劑有限公司;無水葡萄糖、苯酚、Na2HPO4、NaH2PO4、FeSO4·7H2O、鄰菲羅啉、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、鄰苯三酚、Tris-Hcl，天津市恒興化學試劑制造有限公司。

1.2 儀器與設備

振動式藥物超微粉碎機（WZJ-6J），濟南倍力粉技術工程有限公司;超聲波微波組合反應系統（XO-SM200），南京先歐儀器制造有限公司;紫外可見分光光度計：UV-5500PC，上海元析儀器有限公司;電子分析天平：AL-104，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司;電熱鼓風干燥箱：GZX-9240MBE，上海博涵實業有限公司設備廠;冷凍高速臺式離心機：TGL-16M，湘儀離心機儀器有限公司;旋轉蒸發器：RE52CS-2，上海亞榮生化儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料預處理 將白毛木耳切分小塊于50 ℃下烘干至恒重。超微粉碎3、8、10、15、20 min得到不同時間品級的原料干粉，依次經過無水乙醇、乙醚浸提除去醇溶性色素、游離脂肪，反復多次，烘干備用。

1.3.2 繪制葡萄糖標準曲線 參考薩仁高娃等[11]的方法，采用硫酸—苯酚法測定多糖含量。精確吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL C6H12O6標準溶液（1mg/mL）于試管中，分別加蒸餾水至1 mL，依次加入1 mL 6%苯酚溶液、5 mL濃H2SO4后搖勻靜置2 min，沸水反應15 min取出，冷卻至室溫并于490 nm處測定吸光值。

1.3.3 不同提取處理方式對白毛木耳多糖提取率的比較 選取經過1.3.1處理后的白毛木耳粉，比較3種提取方法的多糖提取效果，篩選最佳提取方法：（1）熱水浸提法：將3 g超微粉碎3 min的白毛木耳粉，在料液比為1∶ 60、提取溫度90±5℃、浸提時間6 h、提取劑：H2O的條件下提取后，測定多糖含量。（2）索氏提取法：將3 g超微粉碎3 min的白毛木耳粉，在料液比為1∶ 60、提取溫度95±5 ℃、回流時間6 h、提取劑：H2O的條件下提取后，測定多糖含量。（3）超聲微波聯用法[12]：將3 g超微粉碎3 min的白毛木耳粉，分別在料液比為1∶ 60、提取溫度70 ℃、超聲功率720 W、超聲時間22 min、微波功率600 W、微波時間90s的條件下提取后，測定多糖含量。

1.3.4 Sevege法[13]除蛋白 配制4∶ 1的氯仿/正丁醇溶液，加入4倍白毛木耳多糖粗提液劇烈振蕩混合后，靜置30 min，重復多次至中間層無蛋白。取脫蛋白后的粗提液離心（4 ℃、10 000 r/min、10 min）后，上清液即為粗多糖溶液。

1.3.5 多糖醇沉 取200 mL的粗多糖溶液，加入4倍無水乙醇，4℃醇沉12 h。在11 000 r/min、4℃條件下離心15 min，多組分制備取沉淀，將沉淀復溶后置于冷凍干燥機，干燥完成后的粉末即為白毛木耳粗多糖。

1.3.6 提取成分鑒定[14] （1）茚三酮反應：取1 mL粗多糖溶液，加入2滴0.2%茚三酮，搖勻后沸水浴3 min，冷卻。（2）雙縮脲反應：取1 mL粗多糖溶液，加入3滴10% NaOH，邊搖勻邊加入4滴0.5% H2SO4;（3）DNS顯色反應：取1 mL粗多糖溶液，加DNS試劑2 mL，沸水浴2 min，冷卻后在520nm波長下測定吸光度。（4）硫酸苯酚顯色反應：取1 mL粗多糖溶液，加入1 mL 6%苯酚溶液、5 mL濃硫酸，沸水浴15 min，冷卻后在490 nm波長下測定吸光度。

1.3.7 多糖得率計算

式（1）中，N—多糖得率（%）;C—從標準曲線中求得多糖含量（mg）;A—原料干重（mg）;B—定容體積（mL）;K—稀釋倍數;T—樣品體積（mL）。

1.3.8 不同超微粉碎時間多糖的提取 將超微粉碎3、8、10、15、20 min的白毛木耳粉分別按照1.3.3中確定的方法進行多糖提取，4 ℃保存備用。

1.3.9 白毛木耳多糖體外抗氧化研究

（1）OH-自由基清除能力測定：利用Fenton法[13]反應原理，測定多糖對清除羥基自由基的能力。配置濃度梯度為10、8、4、2、1、0.5、0.25 mg/mL的白毛木耳多糖溶液。按照表1試劑依次加入，搖勻并置于37 ℃水浴中反應1 h，冷卻至室溫，于510 nm處測定吸光值。

式（2）中，B—OH-自由基清除率;A0—空白組吸光值;A1—對照組吸光值;A2—樣品組吸光值。

（2）O2-自由基清除能力測定：采用鄰苯三酚自氧化法[13]測定白毛木耳中多糖對超氧自由基的清除能力。配置濃度梯度為4、1、0.5、0.25、0.125 mg/mL的白毛木耳多糖溶液。按照表2依次加入，搖勻置于25 ℃水浴中反應4 min，取出后加入5滴10 mol/L的鹽酸，充分振蕩終止反應，迅速于波長325 nm處測定吸光值。

式（3）中，F—O2-自由基清除率;A0—空白組吸光值;A樣—樣品吸光值。

（3）DPPH自由基清除能力測定：精確稱取4 mg DPPH，無水乙醇溶解定容至100 mL容量瓶中。配置濃度梯度為10、8、4、2、1、0.5、0.25 mg/mL的白毛木耳多糖溶液，按表3依次加入，充分混勻，避光反應30 min，于波長517 nm處測定吸光值。

式（4）中，M—DPPH自由基清除率、AP—空白組吸光值、AD—對照組吸光值、AQ—樣品組吸光值。

2 結果與討論

2.1 繪制葡萄糖標準曲線

以吸光值（A）為縱坐標、葡萄糖含量（mg）為橫坐標作回歸分析，得回歸方程：y=10.373x-0.015 5，R2=0.999 2（圖1）。

2.2 提取成分鑒定結果

由表4可知，白毛木耳多糖溶液中含有還原糖、多糖，不含有氨基酸、蛋白質，故可測定其抗氧化性能。

2.3 不同提取處理方式對白毛木耳多糖提取率的影響 ?由圖2可知，用熱水浸提法和索氏提取法提取超微粉碎處理3 min的白毛木耳粉，多糖得率分別是3.8%、4.7%;使用超聲微波聯合提取法提取白毛木耳中的多糖時，得率大幅度增加，為11.0%，較前兩者分別增加了7.2%、6.3%。熱水浸提法和索氏提取法僅是通過提取劑將毛木耳粉的胞外多糖進行提取，而超聲微波聯用可通過超聲輔助對細胞壁進行破碎，使胞內多糖溶出。因此，超聲微波聯合提取白毛木耳多糖高效節能，本文選擇該方法提取白毛木耳多糖。

2.4 不同超微粉碎時間對白毛木耳粉多糖提取率的影響 ?由圖3可知，隨著粉碎時間的增加，多糖提取得率明顯增大。超微粉碎3 min和20min的白毛木耳粉中多糖得率分別為11.0%、48.0%，多糖得率增加了38.0%;10～20min時，多糖得率上升幅度逐漸變緩。造成這種原因是隨著超微粉碎時間的延長，物料粒度減小，細胞壁破碎，多糖快速溶出，多糖得率大幅度提高。

2.5 不同超微粉碎時間對白毛木耳多糖抗氧化性質的影響2.5.1 白毛木耳多糖對OH-自由基清除作用 由圖4可知，不同超微粉碎時間的白毛木耳粉中多糖溶液，在多糖溶液相同濃度下隨著超微粉碎時間的增加，對羥基自由基的清除能力是依次上升的;同一超微粉碎時間的白毛木耳粉，當多糖溶液的濃度增加時，對羥基自由基的清除能力也是依次上升的。提取超微粉碎8、10、15、20 min時的白毛木耳粉中的多糖溶液，在濃度為0.25 mg/mL時，OH-自由基清除率分別為6.5%、7.9%、9.9%、11.9%，相比超微粉碎3 min時多糖溶液的清除率分別增加了0.4%、1.8%、3.8%、5.8%，即超微粉碎時間20 min時多糖對OH-自由基的清除率是最佳的。超微粉碎20 min時原料中提取的多糖對OH-自由基的清除率，在濃度10 mg/mL時比8 mg/mL迅速增加了12.5%，較超微粉碎15 min時提取的多糖溶液（10 mg/mL）清除率增加了11.6%，因此超微粉碎時間20 min時提取的多糖，清除率最佳。白毛木耳多糖對OH-自由基的清除能力不強，這與前人對鐵皮石斛多糖[15]的研究相似。

2.5.2 白毛木耳多糖對DPPH自由基清除作用 由圖5可知，相同超微粉碎時間的原料多糖提取液濃度增高時，對DPPH自由基的清除能力依次上升;不同超微粉碎時間的原料多糖提取液，在相同濃度下隨著超微粉碎時間的增加，對DPPH自由基的清除能力先上升后降低。超微粉碎3、10、15、20 min時的白毛木耳多糖溶液，在濃度為10.0 mg/mL時，DPPH自由基清除率分別為70.0%、73.8%、39.2%、36.4%，較超微粉碎時間為8min時的清除率分別減小了9.7%、5.9%、40.5%、43.3%;超微粉碎時間為8min時，相比10 mg/mL增幅為18.1%，較超微粉碎3 min時提取的多糖溶液（10 mg/mL）清除率增加了9.7%。綜上，超微粉碎時間8 min時提取的多糖，清除率最佳。造成此現象原因是超微粉碎時間越長，多糖的分子量隨之減小，抗氧化能力減弱[16]。

2.5.3 白毛木耳多糖對O2-自由基清除的作用測定 由圖6可知，相同超微粉碎時間的原料多糖提取液濃度增高時，對O2-的清除能力依次上升;不同超微粉碎時間的原料多糖提取液，在相同濃度下隨著超微粉碎時間的增加，對O2-的清除能力先上升后降低。提取超微粉碎3、8、10、20 min時的白毛木耳粉中的多糖溶液，4.0 mg/mL時O2-自由基清除率分別為35.1%、42.7%、55.2%、52.3%，相比超微粉碎時間為15 min時的白毛木耳粉中多糖的清除率分別減小了57.4%、49.8%、37.3%、40.2%，即超微粉碎時間15 min時多糖對O2-自由基的清除率是最佳的。超微粉碎15min時原料中提取的多糖對O2-自由基的清除率，在濃度4.0 mg/mL時比1.0 mg/mL迅速增加了8.9%，較超微粉碎10 min時提取的多糖溶液（4.0 mg/mL）清除率增加了37.3%，因此超微粉碎時間15 min時提取的多糖，O2-清除率最佳。這與馬亞麗[16]對油菜花多糖的研究相同，多糖的生物活性能力的不同與多糖分子量的大小密切相關。

3 結論

在超聲空化效應和微波的聯合作用下，白毛木耳多糖的提取率較索氏提取法、熱水浸提法有大幅提高。超微粉碎20min時的白毛木耳多糖對OH-自由基的清除率達到最高29.4%;超微粉碎8min時物料中的多糖對DPPH自由基的精除率最強達到79.7%;超微粉碎15min時物料中的多糖對超氧陰離子自由基的清除能力最強達到92.5%。經過振動式藥物超微粉碎機處理白毛木耳，粉碎時間與多糖得率呈正相關，從10～15min多糖得率增幅為19%。因此，不同超微粉碎時間白毛木耳粉中多糖的抗氧化能力呈現一定的量效關系且原料粒度對多糖得率影響較大。

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Abstract：Auricularia polytricha was crushed by vibratory type superfine pulverizer in this experiment and the effects of grinding time on the extraction rate of polysaccharides and the antioxidation of polysaccharides were studied.The polysaccharide was extracted by hot water leaching，sol extraction and ultrasonic microwave，and the yield was 3.8%，4.7% and 11.0%，respectively，with super-slightly crushed 3 min white fungus powder.The agaric powder was finely crushed for 0 to 20 minutes then extracted by ultrasonic microwave method，we found that the highest rate of polysaccharide was 48.0% at 20 minutes.The antioxidant properties of polysaccharides prepared at different times of superfine grinding were studied.Polysaccharides obtained after 20 minutes of ultrafine crushing had the highest removal rate of hydroxyl free radical，reaching 29.4%.The highest removal rate of DPPH free radicals was the polysaccharides obtained after 8 minutes of ultrafine crushing，reaching 79.7%.The highest removal rate of superoxide anion radical was the polysaccharides obtained after 15 minutes of ultrafine crushing，reaching 92.5%.There was a positive correlation between the time of vibrating superfine grinding and the extraction rate of polysaccharides of Auricularia polytricha，however，there was no positive correlation between hydroxyl free radical，DPPH free radical and superoxide anion radical.

Keywords：vibration ultrafine pulverization;crushing time;Auricularia polytricha;polysaccharide;antioxidant

（責任編輯 唐建敏）