紫檀芪對2型糖尿病大鼠腎臟的影響

劉欣欣 孫華磊 葛惠娜 王騰 李文杰

摘 要：目的：研究紫檀芪對2型糖尿病大鼠腎臟的影響。方法：采用高糖高脂飲食結合小劑量鏈脲菌素構建2型糖尿病大鼠模型。將大鼠隨機分為正常對照組、2型糖尿病組、紫檀芪低劑量組、紫檀芪中劑量組、紫檀芪高劑量組。干預7w后，檢測大鼠血糖和血脂的變化，測定腎功能指標血尿素氮和血肌酐的含量及腎臟氧化應激水平，取腎臟組織做HE染色，觀察大鼠腎組織病理學變化。結果：2型糖尿病組大鼠血糖、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平升高，低密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平降低;血尿素氮和血肌酐升高;腎臟組織的超氧化物歧化酶（SOD）活性下降，丙二醛（MDA）水平升高;腎組織局部可見大量炎性細胞灶性浸潤，炎癥灶周圍腎小管上皮細胞廣泛水腫。紫檀芪干預后，血糖、TG、TC、LDL-C水平降低;血尿素氮和血肌酐降低;腎臟組織的SOD活性升高，MDA水平下降;腎小球和腎小管病變減輕。結論：紫檀芪能夠降低血糖和血脂、血尿素氮和血肌酐，改善腎臟的病理損傷，對2型糖尿病大鼠腎臟的損傷具有一定的治療作用。

關鍵詞：2型糖尿病;紫檀芪;腎臟

2型糖尿病占所有糖尿病的比例為93.7%。中國已成為2型糖尿病患病率增長較快的國家之一，每年大約新增100萬2型糖尿病患者。預防和控制2型糖尿病及其慢性并發癥是世界各國面臨的嚴峻挑戰[1-2]。

紫檀芪（pterostilbene，PTE）是一種廣泛存在于天然產物中的二苯乙烯類化合物，主要提取自藍莓和葡萄籽，有研究證明，紫檀芪為中國珍稀傳統中藥龍血竭的主要成分之一[3]。已有研究表明，紫檀芪具有抗氧化及調節糖、脂代謝異常的作用[4-6]。然而紫檀芪對2型糖尿病的腎臟病變是否有影響目前尚未見報道。本研究通過對2型糖尿病大鼠進行紫檀芪干預，觀察大鼠腎功能相關指標的變化及腎臟的形態學表現，探討紫檀芪對2型糖尿病大鼠腎臟的影響，為紫檀芪進一步研究及臨床應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

卓越360全自動生化分析儀，上海科華生物工程股份有限公司;羅氏血糖儀，羅氏診斷產品上海有限公司;甘油三酯測定試劑盒，中生北控生物科技有限公司;總膽固醇測定試劑盒，中生北控生物科技有限公司;高密度脂蛋白膽固醇測定試劑盒，中生北控生物科技有限公司;低密度脂蛋白膽固醇測定試劑盒，中生北控生物科技有限公司;尿素氮測定試劑盒，南京建成生物工程研究所;肌酐測定試劑盒，南京建成生物工程研究所;超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒，南京建成生物工程研究所;丙二醛（MDA）測定試劑盒;南京建成生物工程研究所;鏈脲佐菌素，美國Sigma公司;紫檀芪，上海士豐生物有限公司。

1.2 實驗動物及飼料

選取SPF級健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠100只，由河南省實驗動物中心提供，飼養于鄭州大學公共衛生學院動物實驗中心。室溫為18～23℃，相對濕度為45%～55%，通風良好，動物分籠飼養，自由飲水攝食，晝夜間隔12h。

普通飼料，由河南省實驗動物中心提供，高脂高糖飼料：59.5%普通粉狀飼料、20%蔗糖、10%豬油、10%蛋黃粉、0.5%膽酸鈉。

1.3 實驗方法

1.3.1 2型糖尿病大鼠模型的建立及實驗分組 100只4w齡雄性SD大鼠，體重170～220g，適應性喂養1w后，隨機選取10只作為正常對照組，給予普通飼料喂養，其余大鼠給予高脂高糖飼料。4w后夜間禁食12h，按40mg/kg劑量一次性空腹注射鏈脲佐菌素STZ溶液，制備2型糖尿病大鼠模型。正常對照組大鼠腹腔注射相等體積的檸檬酸鈉緩沖液。注射STZ72h后，尾靜脈采血檢測大鼠空腹血糖，若空腹血糖≥11.1mmol/L，并且出現多飲、多食、多尿癥狀即為造模成功[7-8]。按上述成膜標準篩選出75只大鼠，造模成功率為83.3%。隨機選取造模成功的大鼠分為2型糖尿病組、紫檀芪低劑量干預組（20mg/kg）、紫檀芪中劑量干預組（40mg/kg）、紫檀芪高劑量干預組（80mg/kg），各10只，于每日固定時間按照體重計算灌胃劑量進行灌胃1次。正常對照組和2型糖尿病組于每日固定時間給予羧甲基纖維素鈉溶液灌胃1次。連續干預7w后，腹腔主動脈取血測定各項生化指標。

1.3.2 血糖和血脂的測定 采用全自動生化分析儀檢測血糖和血脂各項指標，檢測方法參照試劑盒說明，空腹血糖（FBG）測定采用葡萄糖氧化酶法，甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）測定采用一點終點法，低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）測定采用兩點重點法，高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）測定采用過氧化氫酶清除法。

1.3.3 血尿素氮和血肌酐的檢測 干預7w后，采用脲酶法測定血清中尿素氮（SCr）的含量，肌氨酸氧化酶法測定血清中肌酐（BUN）的水平，操作步驟參照試劑盒說明。

1.3.4 腎臟組織氧化應激水平的測定 血樣采集完畢，斷頭處死大鼠，取出腎臟組織，將部分腎臟組織加入PBS中研磨成10%的組織勻漿，3 000r/min離心10min，取上清，采用Bradford法測定蛋白含量，以黃嘌呤氧化酶法檢測SOD 活性，硫代巴比妥酸染色法檢測MDA含量，操作步驟參照試劑盒說明。

1.3.5 腎臟形態學的觀察 首先用PBS緩沖液沖洗腎臟組織，然后用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，HE染色，中性樹脂封片后于顯微鏡下觀察。

1.3.6 統計學分析 數據采用SPSS 21.0進行統計分析，實驗結果以均值±標準差（±s）來表示，多組間均值比較采用單因素方差分析，組間兩兩數值比較用LSD法，檢驗水準為α=0.05。

2 結果與分析

2.1 紫檀芪對各組大鼠血糖、血脂的影響

前期實驗結果[8]表明，干預7w后，與正常對照組相比，2型糖尿病組大鼠FBG、TG、TC、LDL-C水平升高，HDL-C水平降低，差異有統計學意義（P<0.05）。與2型糖尿病組相比，紫檀芪低劑量組和中劑量組的FBG降低，具有統計學差異（P<0.05）;紫檀芪低劑量組、中劑量組和高劑量組TG水平降低，具有統計學差異（P<0.05）;紫檀芪低劑量組和中劑量組大鼠TC、LDL-C水平降低，差異有統計學意義（P<0.05）。紫檀芪低劑量組、中劑量組和高劑量組HDL-C水平與2型糖尿病組比較無統計學差異（表1）。

2.2 紫檀芪對各組大鼠血尿素氮和血肌酐的影響

與正常對照組相比，2型糖尿病組大鼠中血清BUN和SCr值升高，有統計學差異（P<0.05）。與2型糖尿病組相比，紫檀芪低劑量干預組BUN值降低，紫檀芪低劑量、中劑量組SCr值下降，差異有統計學意義（P<0.05）（表2）。

2.3 紫檀芪對各組大鼠腎臟氧化應激水平的影響

與正常對照組相比，2型糖尿病組大鼠腎臟組織的SOD活性下降，MDA水平升高，具有統計學差異（P<0.05）。與2型糖尿病組相比，紫檀芪低劑量和中劑量干預組的SOD活性升高，MDA水平下降，差異有統計學意義（P<0.05）（表3）。

2.4 紫檀芪對各組大鼠腎臟形態學的影響

如附圖所示，正常對照組中大鼠腎組織結構正常，腎小球、腎小管未見明顯病變。2型糖尿病組中腎組織局部可見大量炎性細胞灶性浸潤;炎癥灶內腎小管結構模糊或消失;炎癥灶周圍腎小管上皮細胞廣泛水腫，細胞腫脹，胞漿疏松淡染或呈空泡狀。紫檀芪低劑量干預組中，可見腎小球周圍較多炎性細胞浸潤，以淋巴細胞為主;炎癥灶內少量腎小管結構模糊;少量腎小管上皮細胞水腫，細胞腫脹，胞漿疏松淡染或呈空泡狀。紫檀芪中劑量干預組中，可見腎小球及血管周圍可見炎性細胞浸潤，以淋巴細胞為主;少量腎小管上皮細胞水腫，細胞腫脹，胞漿疏松淡染;血管肌細胞內多可見呈空泡，將胞核擠壓成月牙狀。紫檀芪高劑量干預組中，可見血管周圍極少量炎性細胞浸潤，以淋巴細胞為主;極少量腎小管上皮細胞水腫。因此，不同劑量的紫檀芪對腎小球和腎小管的病變有不同程度的改善。

3 結論與討論

本課題通過高糖高脂飼料聯合小劑量STZ的方式構建2型糖尿病大鼠模型。在2型糖尿病大鼠模型誘導成功后，給予不同劑量的紫檀芪進行干預。結果發現，紫檀芪能夠降低2型糖尿病大鼠的血糖和血脂，此結果與文獻[5-6]等報道一致。糖尿病累及腎小球毛細血管，臨床表現為BUN和SCr的增高[9]。BUN為蛋白質的分解產物，在人體通過腎小球過濾后隨尿液排出體外[10]。SCr為肌酸代謝的終末產物，主要經腎小球濾過，在腎小管幾乎不被重吸收而流出體外[11]。在腎功能正常情況下，BUN和SCr從腎小球濾過，故作為腎小球濾過功能的診斷指標。本研究中，2型糖尿病大鼠腎功能受損，腎小球濾過率下降，BUN和SCr升高。經紫檀芪干預后，BUN和SCr有所下降，結果提示，紫檀芪可以提高腎小球濾過率。高血糖可誘導活性氧簇（ROS）的蓄積并導致氧化應激，當SOD活性降低時，自由基則攻擊細胞，導致細胞受損，MDA的含量間接反映組織的氧自由基含量和細胞損傷程度[12]。當機體出現氧化與抗氧化系統異常時，其氧化能力顯著升高，甚至超越抗氧化能力，進而導致腎臟組織的氧化損傷[13]。本研究中，2型糖尿病組大鼠腎臟組織的SOD活性下降，MDA水平升高。紫檀芪干預后，腎臟組織的SOD活性升高，MDA水平下降。因此，應用抗氧化劑紫檀芪干預2型糖尿病可改善機體氧化應激狀態，進而減輕氧化損傷，起到改善腎臟功能的作用。以往研究很少涉及紫檀芪對2型糖尿病腎臟功能的影響。2型糖尿病患者由于機體糖、脂代謝紊亂可以引起腎臟組織等實質性器官的病變，隨著機體代謝異常的加劇，腎功能障礙加重，腎臟組織發生的器質性病變能夠引發相應的疾病。本研究還發現，紫檀芪可以改善2型糖尿病大鼠腎臟的病理變化，減少腎臟的腎小球和腎小管病變，起到緩解和改善腎臟功能的作用。本研究發現，紫檀芪在改善2型糖尿病的糖、脂代謝紊亂的同時，也可緩解腎臟組織的病變。這可能與紫檀芪多靶點作用有關：紫檀芪可以激活過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR-γ），還可以調節氧化應激反應，并能夠抑制炎癥反應[4]。

綜上所述，紫檀芪可以降低2型糖尿病大鼠的血糖、血脂及BUN、SCr水平，并改善大鼠腎臟的組織形態，提示紫檀芪對2型糖尿病大鼠腎臟的損傷具有一定的治療作用，以上研究結果為紫檀芪作為天然活性物質在功能食品研制和藥品開發方面提供科學依據。

參考文獻

[1]Kerner W，Bruckel J.Definition，classification and diagnosis of diabetes mellitus[J].Exp Clin Endocrinol Diabetes，2014，122（7）：384-386.

[2]中華醫學會糖尿病學分會.中國2型糖尿病防治指南[J].中國醫學前言雜志，2015，7（3）：26-89.

[3]Fan LL，Tu PF，Chen HB，et al.Simultaneous quantification of five major constituents in stems of Dracaena plants and related medicinal preparations from China and Vietnam by HPLC-DAD[J].Biomed Chromatogr，2009，23（11）：1191-1200.

[4]McCormack D，McFadden D.A review of pterostilbene antioxidant activity and disease modification[J].Oxid Med Cell Longev，2013（2013）：1-15.

[5]Pari L，Satheesh MA.Effect of pterostilbene on hepatic key enzymes of glucose metabolism in streptozotocin- and nicotinamide-induced diabetic rats[J].Life Sci，2006，79（7）：641-645.

[6]Rimando AM，Nagmani R，Feller DR，et al.Pterostilbene，a new agonist for the peroxisome proliferator-activated receptor alpha-isoform，lowers plasma lipoproteins and cholesterol in hypercholesterolemic hamsters[J].J Agric Food Chem，2005，53（9）：3403-3407.

[7]劉丹丹，張偉，朱浩，等.Ⅱ型糖尿病大鼠動物模型的構建與驗證[J].中國獸醫學報，2016，36（7）：1201-1205.

[8]劉欣欣，孫華磊，王騰，等.紫檀芪對2型糖尿病大鼠血脂的改善及對PPARγ的調控作用[J].現代食品科技，2018，34（9）：1-6.

[9]李冰，王靜鳳，楊延存，等.蛹蟲草對糖尿病大鼠腎臟病程發展的抑制作用[J].食品科學，2011，32（15）：255-259.

[10]劉月嬌，徐雷雷，柳東，等.海參磷脂型二十碳五烯酸對鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠腎臟功能改善作用的研究[J].食品工業科技，2012，33（19）：331-334.

[11]孫培榮，石永兵.尿白蛋白/肌酐比值對診斷早期糖尿病腎病的價值[J].現代臨床醫學，2007，33（1）：3-4.

[12]Pitocco D，Tesauro M，Alessandro R，et al.Oxidative stress in diabetes：implication for vascular and other complications[J].Int J Mol Sci，2013，14（11）：21525-21550.

[13]Rubattu S，Mennuni S，Testa M，et al.Pathogenesis of chronic cardiorenal syndrome：is there a role for oxidative stress？[J].Int J Mol Sci，2013，14（11）：23011-23032.

Abstract：Objective ?To explore the influence of pterostilbene on renal tissues of type 2 diabetic rats.Method ?Type 2 diabetes model（T2DM）was induced by high-fat and high-sugar diet combined with streptozotocin（40mg/kg）.Rats were randomly divided into normal control group，type 2 diabetes mellitus（T2DM）group，PTE low dose group，PTE middle dose group and PTE high dose group.After treatment of pterostilbene，fasting blood glucose（FBG）and blood lipid，BUN and SCr were examined，the activity of SOD and the level of MDA in renal tissues were evaluated，the morphology of kidney was observed.Result ?It was illustrated that FBG，TG，TC，LDL-C，BUN and SCr were increased，the activity of SOD reduced，and the level of MDA augmented in T2DM group.A large number of inflammatory cell infiltrated the renal tissues，and the extensive edema of renal tubular epithelial cells were found.After intervention，FBG，TG，TC，LDL-C，BUN and SCr were decreased，the activity of SOD increased，and the level of MDA reduced.The morphological change of kidney was relived.Conclusion ?Pterostilbene can reduce FBG and blood lipid，BUN and SCr，improve the pathological damage of kidney，therefore，have certain therapeutic effect on kidney in T2DM rats.

Keywords：type 2 diabetes;pterostilbene;renal tissue

（責任編輯 李婷婷）