補骨脂素和補骨脂酚舒張血管的作用機制研究

瞿晶田 王家龍 柴士偉 劉芳

摘 要 目的：探討補骨脂素和補骨脂酚舒張血管的作用機制。方法：取大鼠胸主動脈制備離體血管環及去內皮血管環。采用血管收縮率為考察指標，分別以一氧化氮合酶抑制劑N-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME，100 μmol/L）預孵育內皮完整或去內皮血管環后，考察低、中、高劑量補骨脂素或補骨脂酚（0.1、1、10 μmol/L）對去甲腎上腺素（NE，1 μmol/L）或氯化鉀（KCl，60 mmol/L）預收縮血管環的舒張作用;分別以鈣依賴型鉀離子通道抑制劑氯化四乙胺（TEA，0.1 mmol/L）、內向整流型鉀離子通道抑制劑氯化鋇（BaCl2，0.1 mmol/L）預孵育去內皮血管環后，考察低、中、高劑量補骨脂酚（0.1、1、10 μmol/L）對NE（1 μmol/L）預收縮去內皮血管環的舒張作用。采用膠原酶-中性蛋白酶混合消化法分離大鼠心臟微血管內皮細胞，采用酶聯免疫吸附法考察低、中、高劑量補骨脂素或補骨脂酚（0.1、1、10 μmol/L）對細胞中內皮型一氧化氮合酶（eNOS）蛋白表達的影響。結果：各劑量補骨脂素和補骨脂酚均能顯著降低NE預收縮的內皮完整血管環收縮率（P<0.01），中、高劑量補骨脂素和補骨脂酚能顯著降低KCl預收縮的內皮完整血管環收縮率（P<0.05或P<0.01），而去內皮和抑制一氧化氮合酶后血管環收縮率顯著升高（P<0.05或P<0.01）;中、高劑量補骨脂酚能顯著降低NE預收縮去內皮血管環收縮率（P<0.05或P<0.01），而抑制血管平滑肌內向整流型鉀離子通道后血管環收縮率顯著升高（P<0.01）。各劑量補骨脂素和補骨脂酚均能顯著提高大鼠心臟微血管內皮細胞中eNOS蛋白表達水平（P<0.01）。結論：補骨脂素和補骨脂酚可能通過內皮依賴性的NO途徑以及促進內皮細胞中eNOS蛋白表達來發揮血管舒張作用;補骨脂酚還可能通過開放內向整流型鉀離子通道這一非內皮依賴途徑發揮血管舒張作用。

關鍵詞 補骨脂素;補骨脂酚;血管舒張;血管內皮細胞;血管平滑肌細胞;鉀離子通道;機制

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To investigate the vasodilatory effect mechanism of psoralen and bakuchiol. METHODS： The rat thoracic aorta was isolated to prepare vascular rings and de-endothelium vascular rings. Using contraction rate as index， the intact endothelium or de-endothelium vascular rings were pre-incubated with N-nitro-L-arginine methyl ester （L-NAME， 100 μmol/L）; vasodilatory effect of low-dose， medium-dose and high-dose of psoralen or bakuchiol（0.1，1，10 μmol/L）on aortic vessels pre- contracted with norepinephrine （NE， 1 μmol/L） or potassium chloride （KCl， 60 mmol/L） were investigated. The de-endothelium vascular rings were pre-incubated with calcium dependent potassium channel inhibitors tetraethylammonium chloride （TEA， 0.1 mmol/L） and inward rectifying potassium channel inhibitor barium chloride （BaCl2，0.1 mmol/L）; vasodilatory effect of low-dose， medium-dose and high-dose of bakuchiol （0.1， 1， 10 μmol/L） on de-endothelium vascular vessels pre-contracted with NE （1 μmol/L） were investigated. The microvascular endothelial cells were isolated by collagenase-neutral protease digestion; the effects of low-dose， medium-dose and high-dose of psoralen or bakuchiol （0.1， 1， 10 μmol/L） on the expression of eNOS protein were studied by ELISA. RESULTS： Psoralen and bakuchiol could significantly reduce the contraction rate of endothelium-intact aortic rings pre-contracted with NE（P<0.01）; medium-dose and high-dose of psoralen and bakuchiol could significantly reduce the contraction rate of? endothelium-intact aortic rings pre-contracted with KCl（P<0.05 or P<0.01）; while the contraction rate could be increased by de-endothelium and NOS inhibition significantly （P<0.05 or P<0.01）. The medium-dose and high-dose of bakuchiol could significantly reduce the contraction rate of? de-endothelium vascular vessels pre-contracted with NE （P<0.05 or P<0.01）. The contraction rate could be increased by inhibiting inward rectifier potassium channels in vascular smooth muscle （P<0.01）. Different dosages of psoralen and bakuchiol could significantly increase the expression levels of eNOS protein in rat cardiac microvascular endothelial cells（P<0.01）. CONCLUSIONS： Psoralen and bakuchiol may play a role in vasodilation via endothelium-dependent NO pathway and by promoting eNOS protein expression in endothelial cells; bakuchiol may play a role in vasodilation via non-endothelium dependent pathway as opening inward rectifying potassium channel.

KEYWORDS? ?Psoralen; Bakuchiol; Vasodilation; Vascular? endothelial cell; Vascular smooth muscle cells; Potassium channel; Mechanism

補骨脂為豆科植物補骨脂（Psoralea corylifolia L.）的干燥成熟果實，其醇提物可通過促進內皮細胞一氧化氮（NO）和前列環素釋放、抑制平滑肌細胞經典瞬時受體電位3（TRPC3）通道活性，從而發揮血管舒張作用[1]。但是該舒張血管作用的物質基礎并未明確。補骨脂中含有多種化學成分，既往研究表明，8-甲氧基補骨脂素可抑制血管平滑肌細胞內鈣離子釋放和細胞外鈣離子內流，通過非內皮依賴途徑發揮血管舒張作用;補骨脂呋喃香豆精可激活血管NO-環鳥苷酸（cGMP）信號通路，通過內皮依賴途徑發揮血管舒張作用[2-5]。有研究發現，補骨脂素、異補骨脂素、異補骨脂查爾酮和補骨脂酚均有舒張大鼠離體胸主動脈血管的作用[1]，但是關于其作用機制的研究并未深入展開。藥物發揮對血管的直接舒張作用主要涉及血管內皮細胞和血管平滑肌細胞兩個途徑：藥物作用于血管內皮細胞，通過促進其舒血管因子（如NO、前列環素或內皮衍生超極化因子）的釋放或表達發揮血管舒張作用;藥物作用于血管平滑肌細胞，通過抑制相關鈣離子通道的開放或促進相關鉀離子通道的開放發揮血管舒張作用[6]。基于此，本研究在前人研究基礎上，以大鼠胸主動脈血管環及心臟微血管內皮細胞為對象，探討補骨脂中主要入血成分補骨脂素和補骨脂酚[7-8]舒張血管作用的可能機制。

1 材料

1.1 儀器

MSA224S-000-DA型電子分析天平（德國Sartorius公司）;Radnoti型組織器官灌流系統、Maclab AID型生物信號采集系統（澳大利亞Powerlab公司）;Felex Station 3型多功能酶標儀（美國MD 公司）;Direct-Q3型超純水系統（美國Millipore 公司）。

1.2 藥品與試劑

補骨脂素（中國食品藥品檢定研究院，批號：110739-201617，純度：≥98%）;補骨脂酚（批號：F1512066，純度：≥98%）、乙酰膽堿（Ach）、去甲腎上腺素（NE）、N-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）、氯化鈉（NaCl）、氯化鉀（KCl）均購自上海阿拉丁生物科技有限公司;磷酸二氫鉀（KH2PO4）、無水硫酸鎂（MgSO4）、碳酸氫鈉（NaHCO3）、葡萄糖、二甲基亞砜（DMSO）均購自上海麥克林生化科技有限公司;氯化鈣（CaCl2）、氯化鋇（BaCl2）、氯化四乙胺（TEA）均購自美國Sigma公司;胎牛血清（美國Gibco公司）;DMEM/F12培養基（美國Hyclone公司）;熒光標記羊抗兔IgG（武漢博士德生物工程有限公司，貨號：BA1032）;兔源CD31抗體、兔源vWF抗體（英國Abcam公司）;大鼠內皮型一氧化氮合酶（eNOS）酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測試劑盒（上海康朗生物科技有限公司，貨號：Im-E30338）;水為超純水。

K-R試液臨用前以水為溶劑配制（組成為118 mmol/L NaCl、4.7 mmol/L KCl、1.2 mmol/L MgSO4、1.2 mmol/L KH2PO4、25 mmol/L NaHCO3、1.3 mmol/L CaCl2、10 mmol/L葡萄糖）;補骨脂素、補骨脂酚以DMSO為溶劑，NE、Ach、L-NAME、BaCl2、TEA、KCl以水為溶劑，制成相應濃度溶液后用于后續試驗。

1.3 動物

SD大鼠，SPF級，雄性，體質量250～300 g，購自北京斯貝福生物技術有限公司，動物生產許可證號：SCXK（京）2016-002。動物飼養環境：室溫（23±1）℃，人工照明12 h明暗交替，期間自由飲食飲水。

2 方法

2.1 大鼠胸主動脈血管環的制備

取大鼠12只，斷頭處死，迅速開胸分離剪取胸主動脈，置于預冷的K-R試液中，小心去除血管外層脂肪和結締組織后，將其剪成長度為4 mm的血管環。取部分上述血管環，用與其內徑相適應的棉棒從其內壁擦過以去除血管內皮。用一個L型鉤子將血管環懸掛于含有5 mL K-R試液的組織器官灌流系統浴槽內（不斷充入5%CO2、95%O2，維持K-R試液pH 7.4、溫度37 ℃），用另一個L型鉤子連接于生物信號采集系統，測定其張力。各血管環基礎張力為2.0 g，穩定時間不小于90 min。然后加入KCl（60 mmol/L，以藥物/試劑的終濃度計，以下同）至浴槽，使血管環收縮達最大張力不變后（即達到平臺期），以K-R試液沖洗15 min，重復以上操作3次。向浴槽內加入NE（1 μmol/L）收縮血管使達到平臺期，再加入Ach（10 μmol/L）舒張血管，若血管環舒張幅度大于最大收縮率的50%，則可認為血管內皮完整;若血管環舒張張力小于最大收縮率的5%，則可認為內皮去除完全。前處理完畢后進行后續試驗。收縮率（%）=（加入藥物或溶劑作用后的血管環張力-2.0 g）/（NE預收縮血管環達到的最大張力-2.0 g）×100%。

2.2 補骨脂素和補骨脂酚對NE預收縮血管環的舒張作用考察

取“2.1”項下處理好的內皮完整血管環和去內皮血管環進行試驗。試驗分為空白組（內皮完整血管環）、內皮完整組（內皮完整血管環）、去內皮組（去內皮血管環）和L-NAME組[內皮完整血管環，預先以一氧化氮合酶抑制劑L-NAME（100 μmol/L）預孵育20 min]，每組平行考察4個血管環。各組血管環均以NE（1 μmol/L）預收縮使達到最大張力后，內皮完整組、去內皮組和L-NAME組均逐次加入相應藥物（補骨脂素或補骨脂酚的累積劑量分別為0.1、1、10 μmol/L），空白組則加入等體積相應溶劑，作用8 min。測定各組血管環張力并計算收縮率。

2.3 補骨脂素和補骨脂酚對KCl預收縮血管環的舒張作用考察

取“2.1”項下處理好的內皮完整血管環和去內皮血管環進行試驗。試驗分為空白組（內皮完整血管環）、內皮完整組（內皮完整血管環）、去內皮組（去內皮血管環）和L-NAME組[內皮完整血管環，預先以一氧化氮合酶抑制劑L-NAME（100 μmol/L）預孵育20 min]，每組平行考察4個血管環。各組血管環均以KCl（60 mmol/L）預收縮使達到最大張力后，內皮完整組、去內皮組和L-NAME組均逐次加入相應藥物（補骨脂素或補骨脂酚的累積劑量分別為0.1、1、10 μmol/L），空白組則加入等體積相應溶劑，作用8 min，按“2.2”項下方法測定各組血管環張力并計算收縮率。

2.4 補骨脂酚對鉀離子通道抑制劑干預下NE預收縮去內皮血管環的舒張作用考察

取“2.1”項下處理好的去內皮血管環進行試驗。試驗分為去內皮對照組、BaCl2組[血管環預先以內向整流型鉀離子通道抑制BaCl2（0.1 mmol/L）孵育20 min] 、TEA組[血管環預先以鈣依賴型鉀離子通道抑制劑TEA（0.1 mmol/L）孵育20 min]，每組平行考察4個血管環。各組血管環均以NE（1 μmol/L）預收縮使達到最大張力后，逐次加入補骨脂酚（累積劑量分別為0.1、1、10 μmol/L），作用8 min，按“2.2”項下方法測定各組血管環張力并計算收縮率。

2.5 補骨脂素和補骨脂酚對大鼠心臟微血管內皮細胞中eNOS蛋白表達的影響考察

參照文獻方法[9]，將大鼠斷頸處死后，以75%乙醇浸泡5 min后移至超凈工作臺上，取仰臥位固定，沿胸部正中線剪開皮膚，打開胸腔，取出心臟并剪下心臟左心室。采用膠原酶-中性蛋白酶混合消化法分離大鼠心臟微血管內皮細胞，細胞經CD31/vWF免疫熒光鑒定，純度應達90%以上。

采用含1%青鏈霉素的DMEM/F12培養基，將心臟微血管內皮細胞在37 ℃、5%CO2恒溫培養箱中靜置培養，24 h后更換新鮮培養基，以后每3天換液1次，待細胞長滿后用于后續試驗。試驗分為空白組，補骨脂素低、中、高（0.1、1、10 μmol/L）劑量組，補骨脂酚低、中、高（0.1、1、10 μmol/L）劑量組，將細胞以1×106個/孔接種于96孔板，每組設置4個復孔。各加藥組分別加入相應濃度的藥物溶液，空白組加入等體積相應溶劑，然后在37 ℃、5%CO2恒溫培養箱中培養24 h。取出細胞，按ELISA試劑盒說明書操作，采用酶標儀在450 nm波長下測定各孔吸光度，并依據試劑盒說明書計算細胞中eNOS蛋白表達水平，并計算各組eNOS蛋白表達率。eNOS蛋白表達率（%）=（各組蛋白表達水平/空白組蛋白表達水平）×100%。

2.6 統計學分析

采用SPSS 13.0統計軟件對試驗數據進行處理。計量資料均采用x±s表示，組間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 補骨脂素和補骨脂酚對NE預收縮血管環的舒張作用

與空白組比較，不同劑量的骨脂素或補骨脂酚作用于內皮完整血管環后，均能顯著降低血管收縮率（P<0.01），表明補骨脂素和補骨脂酚均具有舒張NE預收縮內皮完整離體血管的作用;1.0、10.0 mol/L的補骨脂酚作用于NE預收縮去內皮血管后，也能顯著降低血管收縮率（P<0.05或P<0.01），而各劑量補骨脂素作用于去內皮血管后未能顯著降低血管收縮率（P>0.05），表明補骨脂酚具有舒張NE預收縮去內皮血管的作用，而補骨脂素不具有該作用。與內皮完整組比較，補骨脂素或補骨脂酚作用于去內皮血管環或L-NAME預孵育的內皮完整血管環后，能顯著升高血管收縮率（P<0.05或P<0.01），表明去除血管內皮或抑制一氧化氮合酶能夠顯著減弱補骨脂素或補骨脂酚對NE預收縮血管的舒張作用，提示兩種成分的舒張血管作用可能與血管內皮和一氧化氮合酶相關。補骨脂素和補骨脂酚對NE預收縮血管環收縮率的影響見表1。

3.2 補骨脂素和補骨脂酚對KCl預收縮血管環的舒張作用

與空白組比較，1.0、10.0 mol/L補骨脂素或補骨脂酚作用于內皮完整血管環后，均能顯著降低血管收縮率（P<0.05或P<0.01），表明上述劑量的補骨脂素和補骨脂酚均具有舒張KCl預收縮內皮完整血管環的作用;而各劑量補骨脂素或補骨脂酚作用于去內皮血管后，血管收縮率不降反升，表明補骨脂素和補骨脂酚均不具有舒張KCl預收縮去內皮血管的作用。與內皮完整組比較，1.0、10.0 mol/L補骨脂素或補骨脂酚作用于去內皮血管環或L-NAME預孵育的內皮完整血管環后，能顯著升高血管收縮率（P<0.05或P<0.01），表明去內皮或抑制一氧化氮合酶能夠顯著減弱補骨脂素或補骨脂酚對KCl預收縮血管的舒張作用，提示兩種成分的舒張血管作用與血管內皮和一氧化氮合酶有關。補骨脂素和補骨脂酚對KCl預收縮血管環收縮率的影響見表2。

3.3 補骨脂酚對鉀離子通道抑制劑干預下NE預收縮去內皮血管環的舒張作用

與去內皮對照組比較，1.0、10.0 mol/L的補骨脂酚作用于BaCl2預孵育的去內皮血管環后，均能顯著升高血管收縮率（P<0.01），表明補骨脂酚對NE預收縮去內皮血管的舒張作用與血管平滑肌內向整流型鉀離子通道有關;各劑量補骨脂酚作用于TAE預孵育的去內皮血管環后，未能顯著升高血管收縮率（P>0.05），表明補骨脂酚對NE預收縮去內皮血管的舒張作用與血管平滑肌鈣依賴型鉀離子通道無關。補骨脂酚對NE預收縮去內皮血管環收縮率的影響見表3。

3.4 補骨脂素和補骨脂酚對大鼠心臟微血管內皮細胞中eNOS蛋白表達的影響

與空白組比較，補骨脂素各劑量組和補骨脂酚各劑量組細胞中eNOS蛋白表達率均顯著升高（P<0.01），表明補骨脂素和補骨脂酚均具有促進大鼠心臟微血管內皮細胞eNOS蛋白表達的作用，詳見表4。

4 討論

補骨脂素和補骨脂酚為中藥補骨脂的主要化學成分。本研究初步闡釋了補骨脂素和補骨脂酚舒張血管的作用機制，為揭示中藥補骨脂血管舒張作用的物質基礎提供了實驗依據。

心血管系統是一個相對封閉的管腔系統，具有血管舒縮調節功能的藥物無論是對血壓的調控還是對心血管保護而言，均具有重要臨床意義。本研究結果顯示，不同劑量補骨脂素或補骨脂酚作用于NE或KCl預收縮的內皮完整的大鼠離體胸主動脈環后，均能顯著降低其血管收縮率，表明兩種成分均具有血管舒張作用。

藥物對血管的舒張作用，可分為內皮依賴性和非內皮依賴性[10]。本研究首先從內皮依賴性方面考察發現，去除血管內皮和一氧化氮合酶抑制劑L-NAME均能顯著抑制補骨脂素和補骨脂酚對血管的舒張作用，說明兩種成分可通過內皮依賴的NO途徑發揮對血管的舒張作用。

在非內皮依賴性方面，藥物可通過抑制血管平滑肌細胞鈣離子通道的開放，或激活血管平滑肌細胞相關鉀離子通道等途徑，發揮血管舒張作用[11-12]。血管的收縮依賴于血管平滑肌細胞外鈣離子內流和細胞內鈣離子釋放，而鈣離子流入的主要途徑為受體操縱型鈣通道和電壓依賴型鈣通道[13-14]。NE可開放受體操控型鈣離子通道，KCl可開放電壓依賴型鈣離子通道[15]。本研究發現，補骨脂素對NE預收縮的去內皮血管未見明顯舒張作用，表明試驗劑量下補骨脂素對受體操控型鈣離子通道的抑制作用不明顯;而補骨脂酚對NE預收縮的去內皮血管具有明顯舒張作用，表明試驗劑量下補骨脂酚對受體操控型鈣離子通道的開放具有明顯影響，可通過非內皮依賴途徑發揮血管舒張作用。補骨脂素和補骨脂酚對KCl預收縮的去內皮血管均未見明顯舒張作用，表明試驗劑量下兩種成分對電壓依賴型鈣離子通道的抑制作用均不明顯。鉀離子通道在調節血管平滑肌舒縮過程中起著重要作用，激活血管平滑肌上的鉀離子通道，可引起細胞膜超極化，進而抑制細胞外鈣離子內流，從而引起血管舒張[6]。血管平滑肌細胞中存在有4種經典的鉀離子通道，包括三磷酸腺苷（ATP）敏感型鉀通道、鈣依賴型鉀通道、電壓依賴型鉀通道和內向整流型鉀通道[16-17]。本研究進一步考察補骨脂酚對不同鉀離子通道抑制劑干預下去內皮血管的舒張作用后發現，內向整流型鉀離子通道抑制劑BaCl2能顯著抑制補骨脂酚的血管舒張作用，表明內向整流型鉀離子通道的開放可能參與了該成分舒張血管的過程;鈣依賴型鉀離子通道抑制劑TEA對補骨脂酚的血管舒張作用未見明顯影響，表明鈣依賴型鉀離子通道的開放可能不參與該成分舒張血管的過程。

除此之外，藥物還可通過促進舒血管因子的釋放或表達，影響相關舒血管離子通道的表達，發揮血管舒張作用[18-21]。本研究發現，補骨脂素和補骨脂酚可促進大鼠心臟微血管內皮細胞eNOS蛋白的表達，這可能為兩種成分發揮血管舒張作用的另一作用機制。有研究表明，補骨脂素和補骨脂酚可激活雌激素受體，進而促進eNOS的表達[22]，兩者的血管舒張作用是否與其雌激素受體激活作用相關，還需要進一步研究。

綜上所述，補骨脂素和補骨脂酚可能通過內皮依賴性的NO途徑以及促進內皮細胞中eNOS蛋白表達來發揮血管舒張作用;此外，補骨脂酚還可能通過開放內向整流型鉀離子通道這一非內皮依賴途徑發揮血管舒張作用。

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（收稿日期：2019-06-18 修回日期：2019-10-31）

（編輯：段思怡）