MTRR和SLCO1B1基因多態性與ALL患兒MTX血藥濃度及HD-MTX致不良反應的相關性研究

何霞 姚平立 吳宇 侯正堯 李星星 陳璐 張麗娟 楊思蕓 肖洪濤 童榮生

摘 要 目的：研究MTRR基因rs1801394位點、SLCO1B1基因rs11045879位點多態性與急性淋巴細胞白血病（ALL）患兒甲氨蝶呤（MTX）血藥濃度及大劑量甲氨蝶呤（HD-MTX）致不良反應的相關性。方法：回顧性收集2015年10月-2018年9月四川省人民醫院收治的接受HD-MTX治療且處于鞏固化療期的四川地區漢族ALL住院患兒70例，采用均相酶擴大免疫法檢測患兒給藥后48、72 h時的血藥濃度，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應法檢測其基因分型;分析MTRR、SLCO1B1基因多態性與MTX血藥濃度[劑量校正濃度（c48 h/D，48 h）、不同血藥濃度范圍（≤0.1、>0.1 μmol/L）患兒比例（72 h）]及不良反應（骨髓抑制、肝功能損害、胃腸道反應、黏膜損傷、皮疹等）的相關性;采用Wald漸進法對不同影響因素（基因多態性、MTX血藥濃度、免疫分型、體質量指數等）與不良反應的相關性進行二元Logistic回歸分析。結果：共檢出MTRR基因AA、AG、GG型患兒31、32、7例，SLCO1B1基因TT、TC、CC型患兒23、37、10例，各基因型頻率均符合Hardy-Weinberg平衡（P>0.05）。MTRR和SLCO1B1各基因型患兒c48 h/D（48 h）以及不同血藥濃度范圍患兒比例（72 h）比較差異均無統計學意義（P>0.05）。MTRR各基因型患兒肝功能損害發生率差異顯著（P<0.05），且AA型顯著高于AG+GG型（P<0.05）;而MTRR基因多態性與其他不良反應發生率，SLCO1B1基因多態性與各不良反應發生率均不相關（P>0.05）。二元Logistic回歸分析結果顯示，ALL患兒肝功能損害與MTRR基因多態性相關，胃腸道反應與72 h血藥濃度>0.1 μmol/L與否相關，黏膜損傷與患兒免疫分型和體質量指數相關，皮疹與患兒體質量相關（P<0.05）。結論：MTRR基因rs1801394位點多態性可能與ALL患兒HD-MTX致肝功能損害的發生相關，但該多態性和SLCO1B1基因rs11045879位點多態性均與患兒體內MTX的血藥濃度無關。

關鍵詞 急性淋巴細胞白血病;兒童;MTRR基因;SLCO1B1基因;單核苷酸多態性;甲氨蝶呤;血藥濃度;不良反應

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the relationships of polymorphism of MTRR gene rs1801394 locus and SLCO1B1 gene rs11045879 locus with drug concentration of methotrexate （MTX） and high-dose MTX （HD-MTX）-induced ADR in acute lymphoblastic leukemia （ALL） children. METHODS： From Oct. 2015 to Sept. 2018， 70 ALL hospitalized children of Han nationality in Sichuan area who received HD-MTX treatment and were in consolidation chemotherapy were selected retrospectively from Sichuan People’s Hospital. The blood concentration of MTX at 48 and 72 hours after administration was measured by EMIT. The genetic typing of MTRR gene rs1801394 locus and SLCO1B1 gene rs11045879 locus were detected with real-time PCR. The relationships of the polymorphism of MTRR gene and SLCO1B1 gene with MTX blood concentration [dose-corrected concentration （c48 h/D，48 h）， the proportion of children with different concentration of MTX （≤0.1， >0.1 μmol/L）] and ADR （such as myelosuppression， liver function damage， gastrointestinal response， mucosal damage， rash， etc.） were analyzed. Binary Logistic regression analysis for the correlation of ADR with different influencing factors （gene polymor- phism， blood concentration of MTX， immunophenotyping， body mass index， etc.） was carried out by Wald method. RESULTS： Totally 31， 32， 7 children with MTRR gene AA， AG and GG genotype， while 23， 37， 10 children with SLCO1B1 gene TT， TC and CC genotype were detected. The distribution of each genotype in 70 children conformed to Hardy-Weinberg equilibrium （P>0.05）. There was no significant difference in c48 h/D（48 h） of children and the proportion of children with different concentration of MTX （72 h） among difterent genotypes of MTRR and SLCO1B1 gene （P>0.05）. There was statistical significance in the incidence of liver function injury in children with different genotypes of MTRR gene （P<0.05）， and the AA genotype was significantly higher than the AG+GG genotype （P<0.05）. There was no correlation of MTRR gene polymorphism with the incidence of other ADR， neither SLCO1B1 gene polymorphism with the incidence of ADR （P>0.05）. The results of Binary Logistic regression analysis showed that liver function damage in ALL children was related to the gene polymorphism of MTRR; gastrointestinal reaction was related to whether the plasma concentration was more than 0.1 μmol/L at 72 h; mucosal damage was related to the immune type and BMI of children; the occurrence of skin allergy was correlated with body weight of children（P<0.05）. CONCLUSIONS： Gene polymorphism of MTRR rs1801394 locus may associated with the occurrence of HD-HTX-induced liver function injury in ALL children， but its polymorphism and gene polymorphism of SLCO1B1 rs11045879 locus are not related to MTX blood concentration in ALL children.

KEYWORDS? ?Acute lymphoblastic leukemia; Children; MTRR gene; SLCO1B1 gene; Single nucleotide polymorphism; Methotrexate; Blood concentration; ADR

急性淋巴細胞白血病（Acute lymphoblastic leukemia，ALL）是B系或T系淋巴細胞在骨髓內異常增生所導致的一種惡性腫瘤，患者常出現發熱、出血或貧血等癥狀。兒童是ALL的高發人群，其治愈率及遠期生存率逐年升高，近5年的總生存率在85%以上[1]。大劑量甲氨蝶呤（High-dose methotrexate，HD-MTX）用藥方案被廣泛用于ALL患兒的臨床治療，但該方案在獲得良好效果、提升治愈率的同時，也會導致骨髓抑制、胃腸道反應等不良反應的發生，且個體差異較大，嚴重影響患兒的用藥依從性[2]。甲氨蝶呤（Methotrexate，MTX）是一種細胞周期特異性的二氫葉酸還原酶抑制劑，可抑制腫瘤細胞DNA的合成，從而影響其生長與繁殖;其代謝過程有諸多轉運體和酶系參與，如還原性葉酸載體、多藥耐藥相關蛋白家族、有機陰離子轉運體家族等，而這些轉運體和酶系編碼基因的單核苷酸多態性（SNP）是造成MTX致不良反應的主要原因[3-5]。其中，甲硫氨酸合成酶還原酶（MTRR）是葉酸代謝的關鍵酶，在同型半胱氨酸再甲基化為甲硫氨酸的過程中起著重要作用，其編碼基因MTRR rs1801394（A/G）位點突變會導致MTRR酶活性顯著降低，繼而造成葉酸代謝障礙，從而影響MTX的體內代謝過程[6]。有機陰離子轉運多肽（OATP1B1）由定位于人第12號染色體上的SLCO1B1基因編碼，參與多種藥物從血液向肝細胞的跨膜轉運，MTX是其底物之一[7]。有研究指出，該基因rs11045879（T/C）位點多態性與MTX藥動學特征相關，可影響后者的藥-時曲線下面積（AUC）和清除率（CL）[8]。在現有文獻的基礎上，本研究初步分析了MTRR、SLCO1B1基因的SNP與鞏固化療期ALL患兒應用HD-MTX后血藥濃度分布及不良反應的相關性，旨在為ALL患兒安全應用HD-MTX、減少其化療致不良反應發生提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象

回顧性收集2015年10月-2018年9月四川省醫學科學院/四川省人民醫院（以下簡稱“我院”）收治的70例接受HD-MTX治療的1～16歲四川地區漢族ALL住院患兒的病例資料。

1.2 納入與排除標準

納入標準：確診為ALL，應用中國兒童白血病協作組2008（以下簡稱“CCLG 2008”）化療方案[9]且處于鞏固化療期的漢族患兒。排除標準：其他少數民族或者合并其他類型血液疾病、肝腎疾病、胃腸道功能紊亂、黏膜炎、皮膚病等疾病的患兒。本研究通過我院醫學倫理委員會審核批準[批件號：倫審（研）2015年第52號]，中國臨床實驗中心注冊號：ChiCTR1800015307），患兒監護人均已同意診療方案并簽署知情同意書。

1.3 治療方法

所有患兒均參照《兒童急性淋巴細胞白血病診療建議（第4次修訂）》中所推薦的CCLG 2008化療方案[9]，根據其危險度分級使用注射用甲氨蝶呤（江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，批準文號：國藥準字H32026197，規格：1 g）2～5 g/m2：先以總給藥量的1/10作為突擊劑量于30 min內快速靜脈滴注，余量于23.5 h內勻速靜脈滴注。密切監測患兒的各項臨床指征（包括血細胞分析、肝腎功能檢查等），并予以碳酸氫鈉片（上海信誼天平藥業有限公司，批準文號：國藥準字H31020474，規格：0.5 g）口服進行充分水化和尿液堿化（pH為7.0～8.0），準備足量注射用亞葉酸鈣（江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，批準文號：國藥準字H32022391，規格：按C20H23N7O7計為100 mg）于MTX開始滴注后42 h時以15 mg/m2進行解救，并依據MTX血藥濃度調整亞葉酸鈣劑量。

1.4 考察指標

1.4.1 基本信息 記錄70例ALL患兒的性別、年齡、身高、體質量等信息，并根據《兒童急性淋巴細胞白血病診療建議（第4次修訂）》中的診療規范[9]對患兒進行細胞形態學-免疫學-細胞遺傳學-分子生物學（MICM）診斷分型、微小殘留病（MRD）水平以及臨床危險度分級。

1.4.2 MTX血藥濃度 于給藥后48、72 h采集患兒上肢靜脈血2 mL，置于抗凝管中，以4 000 r /min離心5 min，取上清液適量，采用均相酶擴大免疫法（EMIT）以Viva-E型全自動分析儀（德國Siemens公司）測定，整個測定過程需避光操作。MTX檢測血藥濃度的線性范圍為0.1～2.0 μmol/L，定量下限為0.1 μmol/L，精密度、準確度等方法學經本課題組前期考察均符合要求[10]。因48 h時可檢測到血藥濃度的具體數值，而72 h時的血藥濃度大多未達到定量標準（0.1 μmol/L），缺乏具體數值，故綜合考慮，48 h時的血藥濃度以劑量校正濃度（c48 h/D，即48 h時MTX的血藥濃度與患兒給藥劑量的比值）、72 h時的血藥濃度以不同血藥濃度范圍（≤0.1、>0.1 μmol/L）的患兒比例來進行分析[11]。

1.4.3 基因分型 采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）法檢測患兒基因分型。首先，采用血液基因組柱式小量提取試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司），嚴格按照其說明書方法提取患兒外周血DNA，采用NanoDrop 2000型核酸濃度測定儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）檢測其DNA濃度和純度[DNA濃度為10～30 ng/μL;純度（A260 nm/A280 nm）為1.6～2.0]。采用MTRR和MTHFR基因檢測試劑盒（武漢友芝友醫療科技股份有限公司），嚴格按其說明書方法以7500型實時定量PCR儀（美國Thermo Fisher Scientific公司，下同）檢測MTRR基因rs1801394位點的分型，引物由武漢友芝友醫療股份有限公司設計、合成，上、下游序列分別為5′-AGGCAAAGGCCATCGCAGAAGAAAT-3′、5′- TGTGAGCAAGCTGTGGTACATGGAT-3′。反應體系（共25 μL）：DNA模板1 μL和擴增試劑（含PCR緩沖液、dNTPs、特異性引物和探針、內標引物和探針、Taq酶、UNG酶等）24 μL。反應條件：37 ℃預處理10 min;95 ℃預變性5 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，共40個循環。采用SLCO1B1 Taqman SNP基因分型試劑盒（美國Applied Biosystem公司），嚴格按其說明書方法以7500型實時定量PCR儀檢測SLCO1B1B基因rs11045879位點的分型，引物由美國Applied Biosystem公司設計、合成，上、下游序列分別為5′-TTCTTTGATGATATATATGAAGATG-3′、5′-TTGATTCTGTTATATTAACCCTGGA-3′。反應體系（共25 μL）：DNA模板1 μL、Master Mix 12.5 μL、20×TaqMan SNP Genotypin Assay工作液1.25 μL，用ddH2O補足25 μL。反應條件：60 ℃預處理20 s;95 ℃預變性5 min，95 ℃變性5 s，60 ℃退火60 s，共40個循環;60℃延伸5 min。使用7500型實時定量PCR儀直接測序，并按照相應試劑盒說明書判定其基因分型。

1.4.4 不良反應 鞏固化療期ALL患兒首次應用HD-MTX后7 d，按照美國國立癌癥研究所常見不良反應評價標準（NCI-CTCAE）4.0對患兒進行不良反應分級，當分級≥2時，可認為發生了臨床相關的化療毒副反應[3]。主要評價指標[3]——①骨髓抑制：白細胞計數<3.0×109 L-1，外周血中性粒細胞計數<1.5×109 L-1，淋巴細胞計數<0.8×109 L-1，血小板計數<75.0×109 L-1，血紅蛋白<810.0 g/dL。②肝功能損害：丙氨酸轉氨酶>3.0～5.0倍正常值上限，天冬氨酸轉氨酶>3.0倍正常值上限。③胃腸道反應：經口攝食減少但無明顯的體質量下降，出現脫水或營養不良的惡心且24 h內發作3～5次（間隔5 min）的嘔吐和食欲下降。④黏膜損傷：以中度疼痛、不影響經口攝食、需要調整飲食的口腔黏膜炎為主。⑤皮疹：皮膚表層出現紅點、伴或不伴瘙癢。⑥繼發感染：化療后機體抵抗力低下致需口服藥物治療的感染。⑦神經系統毒性：出現嗜睡、言語障礙等現象。⑧腎功能損害：以急性腎損傷（尿肌酐>164 μmol/L）為主。

1.5 統計學方法

采用Excel 2010對數據進行整理，采用SPSS 24.0軟件進行統計分析。采用χ 2檢驗分析各基因型是否符合Hardy-Weinberg遺傳平衡。采用Shapiro-Wilk法對計量資料進行正態性檢驗，符合正態分布的數據以x±s表示，組間比較采用t檢驗;不符合正態分布的數據以中位數（四分位間距）表示，組間比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗。計數資料以例數或率表示，組間比較采用χ 2檢驗。采用Wald漸進法對各影響因素與患兒不良反應的相關性進行二元Logistic回歸分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患兒一般資料

70例患兒中，男性45例（64.29%）、女性25例（35.71%），其一般信息詳見表1。

2.2 基因分型檢測結果

本研究共檢出MTRR基因型3種，分別為AA、AG、GG型，各31、32、7例;共檢出SLCO1B1基因型3種，分別為TT、TC、CC型，各23、37、10例。各基因型分布頻率均符合Hardy-Weinberg平衡（χ 2分別為0.09、0.63，P>0.05），詳見表2;等位基因頻率（A、G、T、C等位基因頻率分別為0.671、0.329、0.593、0.407）與國際遺傳藥理學數據庫（PharmGKB，https：//www.pharmgkb.org）中我國南方漢族人群的等位基因頻率（樣本量為210例，A、G、T、C等位基因頻率分別為0.748、0.252、0.548、0.452）相近。

2.3 基因多態性與患兒血藥濃度的相關性

MTRR和SLCO1B1各基因型ALL患兒的性別、年齡、身高、體質量、體表面積、體質量指數、分型、危險度等一般資料比較差異均無統計學意義（P>0.05），具有可比性，詳見表1。各基因型患兒c48 h/D（48 h）以及不同血藥濃度患兒比例（72 h）比較差異均無統計學意義（P>0.05），詳見表3。

2.4 基因多態性與患兒不良反應的相關性

MTRR不同基因型患兒肝功能損害發生率差異顯著（P<0.05），且AA型患兒肝功能損害的發生率顯著高于AG+GG型患兒（P<0.05）。而MTRR不同基因型患兒其他不良反應發生率以及SLCO1B1不同基因型患兒所有不良反應的發生率組間比較差異均無統計學意義（P>0.05），詳見表4、表5。

2.5 HD-MTX致不良反應的相關因素分析

回歸分析結果顯示，ALL患兒肝功能損害的發生與MTRR基因rs1801394位點的多態性有關（P<0.05），這與表5的統計結果相對應;但AG型與AA型、GG型與AA型患兒兩兩比較差異均無統計學意義（P>0.05）。此外，胃腸道反應的發生與患兒72 h時血藥濃度>0.1 μmol/L與否有關，黏膜損傷與患兒免疫分型和體質量指數有關（P<0.05）;且與B系患兒相比，T系患兒更易發生黏膜損傷的（P<0.05）;皮疹的發生與患兒體質量有關（P<0.05），詳見表6。

3 討論

MTRR基因位于人第5號染色體上，全長2 094 bp;其中，rs1801394是目前研究較為全面的位點之一，該位點A→G突變可導致編碼的蛋氨酸突變為異亮氨酸，從而影響MTRR酶活性，造成葉酸代謝障礙，最終影響藥物的代謝過程[6]。SLCO1B1基因位于人第12號染色體上，全長10.86 bp;其中，rs11045879位點可發生T→C突變，雖不引起編碼氨基酸的改變，但可影響編碼轉運體的立體結構，從而改變轉運體的活性，影響底物的跨膜轉運[7-8]。本研究通過回顧性分析應用HD-MTX治療的70例鞏固化療期ALL患兒的臨床資料，初步探討了MTRR和SLCO1B1基因多態性與其血藥濃度及不良反應的相關性。

本研究采用實時熒光定量PCR法共檢出MTRR基因3種分型：AA型（31例）、AG型（32例）、GG型（7例）;共檢出SLCO1B1基因3種分型：TT型（23例）、TC型（37例）、CC型（10例）。上述基因各基因型頻率均符合Hardy-Weinberg平衡（P>0.05），等位基因頻率與PharmGKB數據庫中的我國南方漢族人群的等位基因頻率相近，提示本研究受試人群具有群體代表性。

有研究顯示，SLCO1B1基因rs11045879位點CC型與MTX血藥濃度有關，該位點突變是影響ALL患兒MTX藥動學行為的重要因素，與MTX的清除率密切相關，MTX清除率大小依次為TT型>CT型>CC型，該位點多態性可影響患兒臨床療效和安全性，還與MTX的胃腸道毒性相關[3，12];但同時也有相關研究結果表明，rs11045879位點多態性與患兒體內24、48 h時的MTX血藥濃度無關，但與MTX的不良反應發生有關[13]。本研究未觀察到SLCO1B1基因rs11045879位點多態性與MTX血藥濃度及HD-MTX致不良反應發生的相關性，可能與受試人群人種及樣本量有關。

本研究結果顯示，MTRR基因rs1801394位點多態性雖與患兒MTX血藥濃度無關，但與患兒肝功能損害的發生密切相關（P<0.05）;且與G等位基因攜帶者比較，AA型患兒更易發生肝功能損害（P<0.05）。但Logistic回歸分析并未發現GG型與AA型、AG型與AA型患兒肝功能損害發生率的組間差異，筆者認為可能與回歸分析納入的其他因素（如患兒年齡、體質量、體表面積等）有關。甲硫氨酸的活性形式S-腺苷甲硫氨酸是一種良好的肝臟營養劑，可通過質膜磷脂和蛋白質的甲基化來影響肝臟細胞的流動性和微黏性，并通過轉硫基化增加肝內谷胱甘肽、硫酸根和牛磺酸水平，可保護肝臟免受藥物的損害[14]。MTRR也是同型半胱氨酸代謝的重要酶，同型半胱氨酸水平的升高可導致細胞中氧化物和過氧化物增加，從而造成肝臟損害;MTRR基因突變后，MTRR酶活性有所降低，繼而可能造成S-腺苷甲硫氨酸合成降低、同型半胱氨酸水平升高，使得患兒肝功能受損。Huang L等[15]發現，MTRR基因rs1801394位點的多態性可能是引發口腔黏膜受損的風險因素之一，相比AA型，GG型、AG型患者發生口腔黏膜損傷的風險較高。但本研究并未發現類似結果，可能與納入人群、樣本量或者各基因多態性相互影響與其他遺傳、臨床或環境因素共同作用有關，尚需進一步研究證實。有文獻表明，熒光偏振免疫分析法（FPIA）或HPLC法檢測的48 h血藥濃度>1.0 μmol/L和（或）72 h血藥濃度>0.1 μmol/L被認定為MTX排泄延遲，而排泄延遲將會導致骨髓抑制以及口腔黏膜損害等不良反應的增加，同時還會增加胃腸道反應的風險[16]。本研究結果表明，患兒胃腸道反應與72 h血藥濃度>0.1 μmol/L有關（P<0.05），與上述文獻結果[16]基本一致。此外本研究還發現，ALL免疫分型可能是患兒黏膜損傷發生的影響因素之一。有研究表明，ALL的不同免疫分型會影響患兒白血病腫瘤細胞內的MTX及其胞內代謝物多聚谷氨酸化甲氨蝶呤（MTX-PGs）的蓄積濃度，進而影響MTX的藥效，最終導致黏膜損傷等MTX相關不良反應的發生[17]。本研究還發現，皮疹的發生與患兒體質量有關，但目前尚未見同類研究，相關機制有待深入探討。

綜上所述，MTRR基因rs1801394位點多態性可用于預測ALL患兒使用HD-MTX化療所致肝功能損害，但其和SLCO1B1基因rs11045879位點多態性均與患兒體內MTX的血藥濃度無關。由于納入的樣本量有限，故本研究尚存在一定局限性，后續可增大樣本量開展更多相關研究。

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（收稿日期：2018-12-10 修回日期：2019-09-25）

（編輯：張元媛）