灰色關聯度法優化葵花盤“精準炮制”飲片的加工炮制一體化工藝

劉吉爽 段連政 徐文慧 常麗靜 姜柔齊 宮喜艷 陳新 邱智東

摘 要 目的：優化葵花盤“精準炮制”飲片的產地加工炮制一體化工藝。方法：分別以蘆丁、牛血清白蛋白為對照品，采用紫外分光光度法測定葵花盤樣品中的總黃酮和總蛋白含量;參考《中國藥典》方法測定樣品中水溶性浸出物、稀乙醇浸出物、乙酸乙酯浸出物的含量。基于與原藥材保持質量一致性、偏于抗痛風治療和偏于平肝止痛等不同需要，分別以總黃酮、總蛋白含量以及3種不同極性浸出物含量為指標，利用灰色關聯度法優化3種葵花盤“精準飲片”的加工炮制一體化工藝。結果：灰色關聯度分析結果顯示，60 ℃烘干塊狀飲片與原藥材以及偏用于平肝止痛飲片的理想樣本序列關聯度最大;陰干塊狀飲片與偏用于抗痛風治療的理想樣本序列關聯度最大。結論：可針對不同需求采用不同的葵花盤一體化“精準炮制”工藝，如需與原藥材保持質量一致性或需要制備偏于平肝止痛的葵花盤飲片，則可采取切塊、60 ℃烘干的工藝;如需要制備用于抗痛風治療的葵花盤飲片，則可采取切塊、陰干的工藝。

關鍵詞 葵花盤;總黃酮;總蛋白;一體化工藝;精準炮制;灰色關聯度

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To optimize the integrated processing technology for “precise decoction pieces” of Helianthus annuus. METHODS： The contents of total flavonoids and total protein in H. annuus were determined by UV spectrophotometry with rutin and bovine serum albumin as control. Refering to Chinese Pharmacopoeia， the contents of water soluble extract， dilute ethanol extracts and ethyl acetate extract were determined. Based on the different needs such as maintaining quality consistency with the original medicinal materials， preference for anti-gout treatment， preference for liver calming and pain relief， using the contents of total flavonoids， total protein and 3 kinds of polar extract as indexes， gray correlation method was used to optimize the integrated processing technology of 3 kinds of “precise decoction pieces” of H. annuus. RESULTS： Gray correlation analysis showed that the ideal sample sequence of decoction pieces in massive shape dried at 60 ℃ with the original medicinal materials and decoction pieces with preference use of liver calming and pain relief was the most relevant; the ideal sample sequence of ideal sample sequence of decoction pieces in massive shape dried in the shade with decoction pieces with clinical application preference of anti-gout therapy was the most relevant. CONCLUSIONS： Different integrated processing technology for “precise decoction pieces” of H. annuus can be adopted for different needs. If it is necessary to keep the quality consistent with the original medicinal materials or to prepare H. annuus decoction pieces for liver calming and pain relieving， medicinal material can be cut into massive shape and dried at 60 ℃; if it is necessary to prepare H. annuus decoction pieces for anti-gout treatment， cutting into massive shape and drying in the shade can be adopted.

KEYWORDS? ?Helianthus annuus; Total flavonoids; Total protein; Integrated technology; Precise processing; Gray correlation

葵花盤為菊科植物向日葵（Helianthus annuus L.）收取果實后的干燥花序托，在《中藥大辭典》《中華本草》《全國中草藥匯編》以及部分地方習用藥材匯編中均有收載[1-3]。近5年其相關專利已發表近90項，涵蓋痛風病組方配伍、保健食品及新材料應用等方面，且大多集中于組方配伍和保健食品方面。葵花盤在痛風、三叉神經痛等疾病治療領域已表現出顯著療效[4-7]，作為一種新興中藥材逐漸被人們認可。葵花盤主要活性成分為黃酮、多肽類，目前臨床多將其用于平肝止痛和痛風疾病的治療[5-10]。

中藥的產地加工與炮制是生產符合規定飲片的關鍵環節，“軟化”（即以水或其他液體輔料處理藥材，以便使干燥的藥材易于切制，同時有清潔藥材的作用）為中藥切制前的必要操作，針對某些藥材在“軟化”過程中的成分損失，相關學者提出了“產地加工與炮制一體化”的理念，并經商陸、天麻等藥材的一體化工藝實踐后被證實具有一定適用性[11-14]。葵花盤的炮制工藝僅在《浙江省中藥炮制規范》（1986年）中有收載，規定為“除雜，洗凈，潤軟，切塊，干燥”[15]。然而，葵花盤鮮品含水量高、干燥速度慢，且具有海綿組織而極易吸水，故傳統工藝中的“潤制后切”不但會造成有效成分損失，而且還增加了霉變的風險。采用產地加工與炮制一體化工藝則可有效減少切制中浸潤等操作，從而減少“軟化”過程中葵花盤有效成分的損失，提高其生產效率，確保其飲片質量。

中醫藥傳統理論中“辨證施治”“方證對應”等思想，與現代醫學“精準醫療”模式的特點是對應的。本課題組以“精準醫療”概念為指導，針對中藥的不同臨床功效，以適宜的藥效成分為指標優化其加工炮制一體化工藝，制備適于不同疾病需要的高質量飲片，即通過“精準炮制”制備“精準飲片”，以助于臨床治療不同疾病時能達到精準用藥目的。葵花盤具有清熱涼血、平肝止痛之功效，在臨床上主要用于平肝止痛和抗痛風治療，相關報道證實黃酮類、多肽類等為其發揮上述藥效的主要活性成分[2-7]。本研究根據葵花盤的不同臨床應用需要，選擇總黃酮、總蛋白以及3種不同極性浸出物的含量為指標，結合灰色關聯度法優化其加工炮制一體化工藝，制備質量近似于原藥材以及臨床療效分別偏于平肝止痛和抗痛風的葵花盤“精準飲片”，為中醫臨床用藥準確性的進一步提高提供依據。

1 材料

1.1 儀器

T6型紫外-可見分光光度計、TU-1810型紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）;UV 5100型紫外-可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）;GZX-9240 MBE數顯鼓風干燥箱（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）;KQ-250B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;AEY-210型電子天平（長沙湘儀天平儀器設備有限公司）。

1.2 藥品與試劑

蘆丁對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100080-201610，純度：92.6%，供紫外-分光光度法測定用）;牛血清白蛋白對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號：B20923，純度：≥96%）;氫氧化鈉、無水乙醇、磷酸、乙酸乙酯（均為分析純，北京化工廠）;亞硝酸鈉（分析純，天津市光復科技有限公司）;硝酸鋁（分析純，天津市光復精細化工研究所）。

1.3 藥材

葵花盤鮮品采集于吉林省長春市，經長春中醫藥大學張景龍研究員鑒定為菊科植物向日葵（H. annuus L.）收取果實后的干燥花序托。

2 方法與結果

2.1 葵花盤藥材的炮制

根據葵花盤性狀特征，結合中藥炮制傳統切制工藝設計飲片規格。由于葵花盤受光照等因素的影響大，因此為避免個體差異影響，本課題組取葵花盤原藥材，趁鮮切制成塊狀（花盤均等切成立方塊，長、寬、高均約1 cm）或片狀（花盤均勻切成四等份后切片，厚度約2～4 mm），按不同規格分別混勻，隨機等分成數份，分別對其進行烘干（40、50、60、80 ℃）、曬干（日光下暴曬干燥）、陰干（陰涼通風處自然干燥）處理，制得不同規格、不同干燥方式的葵花盤藥材及飲片樣品見表1。

2.2 總黃酮含量測定方法的建立

2.2.1 測定方法 參考文獻方法[16]，對樣品溶液進行顯色反應后，采用紫外-可見分光光度法測定總黃酮含量，檢測波長為505 nm。

2.2.2 對照品溶液的制備 取蘆丁對照品適量，精密稱定，加60%乙醇適量，超聲處理（功率：250 W，頻率：25 kHz）使溶解，放冷，加60%乙醇至刻度，搖勻，制成質量濃度為0.2 mg/mL的蘆丁對照品溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 根據前期試驗優化條件，稱取葵花盤藥材粉末（50目）1 g，置于100 mL圓底燒瓶中，加入石油醚（60～90 ℃）50 mL，加熱回流脫脂處理2 h，濾過，取藥渣在水浴上揮干溶劑，然后同濾紙一并移入圓底燒瓶，精密加入60%乙醇50 mL，稱定，加熱回流提取2 h，放冷至室溫，再次稱定，補足減失的質量，搖勻，濾過，即得。

2.2.4 方法學考察 參照2015年版《中國藥典》（四部）通則9101方法[17]進行方法學考察。（1）標準曲線的建立。取“2.2.2”項下對照品溶液適量，稀釋制成系列線性對照品溶液，依法測定。以對照品質量濃度為橫坐標（X，μg/mL）、吸光度（Y）為縱坐標進行線性回歸，得標準曲線方程為Y=0.013 3X-0.017 8（r=0.999 5），結果表明蘆丁質量濃度在7.526 5～45.159 2 μg/mL范圍內與吸光度線性關系良好。（2）儀器精密度考察。取“2.2.2”項下對照品溶液適量，依法連續測定吸光度6次，結果RSD為0.65%（n=6），表明儀器精密度良好。（3）中間精密度考察。由3名不同操作人員在不同日期內，采用3臺不同型號的紫外-可見分光光度計測定同一供試品溶液吸光度，結果RSD為0.94%（n=3），表明儀器精密度良好。（4）穩定性考察。取“2.2.3”項下供試品溶液適量，分別在室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時測定吸光度，結果RSD為1.34%（n=6），表明供試品溶液穩定性良好。（5）重復性考察。取葵花盤樣品粉末（50目）1 g，共6份，分別按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，測定其吸光度并按標準曲線法計算總黃酮含量（以蘆丁計），結果總黃酮含量RSD為1.96%（n=6），表明方法重復性良好。（6）加樣回收率考察。精密稱取葵花盤粉末（50目）1 g，共6份，分別加入對照品溶液適量（含蘆丁對照品9.98 mg），按“2.2.3”項下方法制備加樣回收供試品溶液，測定吸光度并計算回收率，結果平均回收率為100.92%，RSD為2.59%（n=6），表明本方法準確度良好。

2.3 總蛋白含量測定方法的建立

2.3.1 對照品溶液的制備 取牛血清白蛋白對照品約10 mg，精密稱定，加水使溶解并定容至10 mL，搖勻，制成質量濃度為1 mg/mL的對照品溶液，即得。

2.3.2 供試品溶液的制備? ?取葵花盤樣品粉末（50目）1 g，按料液比1 ∶ 75（g/mL）加入水，于50 ℃超聲提取（功率：250 W，頻率：25 kHz）45 min，濾過，取續濾液，即得。

2.3.3 顯色反應時間的確定 精密吸取供試品溶液適量，加水定容至1.0 mL，加考馬斯亮藍溶液（取考馬斯亮藍G250試劑約0.05 g，加乙醇25 mL使溶解，再加入磷酸50 mL，最后加水定容至500 mL，混勻，濾過，取續濾液，即得）5 mL，顯色反應一定時間后，采用紫外-可見分光光度法在波長595 nm下測定。經考察不同染色時間（1～50 min）對供試品溶液吸光度的影響后發現，顯色反應15 min后供試品溶液吸光度基本保持恒定，故確定總蛋白含量測定方法的顯色反應時間為15 min。

2.3.4 方法學驗證 參照2015年版《中國藥典》（四部）通則9101方法[17]進行方法學考察。（1）標準曲線的建立。取“2.3.1”項下對照品溶液，按“2.2.4（1）”項下方法操作并進行線性回歸，得標準曲線方程為Y=0.666X+0.103 3（r=0.996 7），結果表明對照品質量濃度在0.096 8～0.967 7 mg/mL范圍內與吸光度線性關系良好。（2）儀器精密度考察。取“2.3.1”項下對照品溶液適量，依法連續測定吸光度6次，結果RSD為0.28%（n=6），表明儀器精密度良好。（3）中間精密度考察。取“2.3.2”項下供試品溶液適量，按“2.2.4（3）”項下方法操作，結果RSD為1.37%（n=3），表明方法中間精密度良好。（4）穩定性考察。取“2.3.2”項下供試品溶液適量，按“2.2.4（4）”項下方法操作，結果RSD為1.46%（n=6），表明供試品溶液穩定性良好。（5）重復性考察。稱取葵花盤飲片粉末（50目）1 g，共6份，按“2.2.4（5）”項下方法操作，結果總蛋白含量RSD為2.08%（n=6），表明方法重復性良好。（6）加樣回收率考察。精密稱取葵花盤粉末（50目）1 g，共6份，按“2.2.4（6）”項下方法操作，結果平均回收率為100.92%，RSD為1.40%（n=6），表明方法準確度良好。

2.4 葵花盤樣品質量指標的測定

按照“2.2”“2.3”項下方法分別測定葵花盤樣品中總黃酮和總蛋白含量;同時，按文獻方法[17]依次以水、稀乙醇、乙酸乙酯為溶劑，對樣品浸出物進行測定，結果詳見表2。

2.5 灰色關聯度法優化葵花盤炮制一體化工藝

2.5.1 原理 灰色關聯度法是以灰色理論為基礎的一種相對排序分析，其原理是通過若干個統計數列所構成的各條曲線幾何形狀的相似性來評價因素間的關聯度;關聯序列反映了各個待評價對象與參考對象（即理想樣本）的接近次序，關聯度最大的待評價對象為最接近理想樣本的最佳對象[18]。近年來，利用灰色關聯度法進行中藥質量評價越來越多地被應用和認可[19-22]，本研究即針對藥效關鍵指標，采用灰色關聯度法構建葵花盤飲片質量的評價模型并評價飲片質量。灰色關聯度法相應計算公式[23]如下：（1）無量綱化處理：Ki（j）′=Ki（j）/K1（j），式中K1（j）表示理想樣本指標數據，Ki（j）表示第i個待評價樣品指標數據，待評價樣品編號為i=2，3，…，10，各指標依次為j=1，2，…，p。（2）間距計算：ΔK1i（j）′=|K1（j）′-Ki（j）′|。（3）關聯系數計算：ξ1i（j）=（minΔK1i（j）′+ρ×maxΔK1i（j））/ （ΔK1i（j）′+ρ×maxΔK1i（j）），式中ρ為分辨系數，一般取0.5。（4）待評價樣品與理想樣本K1的關聯度計算：r1i（j）=（?pj=1×ξ1i（j））/p，i=1，2，…，n。

2.5.2 關聯序列的選擇 本課題組考慮到藥材炮制加工成飲片的過程中，某些有效成分可能會減少;同時，基于精準用藥理念，針對葵花盤的兩種主要臨床功效分別選擇相應指標進行評價，即擬制備3種葵花盤“精準飲片”：（1）與原藥材保持質量一致性的葵花盤“精準飲片”;（2）偏于抗痛風治療的葵花盤“精準飲片”;（3）偏于平肝止痛的葵花盤“精準飲片”。對于與原藥材保持質量一致性的飲片，本研究以未經炮制的原藥材為理想樣本，選擇總黃酮類和總蛋白類成分含量以及能反映葵花盤質量的3種極性浸出物含量為指標，對一體化工藝進行優化;對于偏于抗痛風治療的飲片，本研究重點考察其所含堿性多肽類成分，故選擇總蛋白含量以及水溶性浸出物含量最高值為理想樣本;對偏于平肝止痛的飲片，本研究重點考察其所含黃酮類成分，故選擇總黃酮含量以及醇溶性浸提物、脂溶性浸提物含量的最高值為理想樣本。

2.5.3 與原藥材保持質量一致性的葵花盤“精準飲片”一體化工藝優化 以未經炮制的原藥材各指標含量為理想樣本序列，將“2.4”項下測得的K1～K10樣品相應指標代入“2.5.1”項下各公式計算，結果見表3～表5。

根據各指標的關聯系數計算關聯度并對其進行排序，詳見表6。由表5、表6可知，60 ℃烘干塊狀飲片（K4）與理想樣本序列的關聯度最大，其中總黃酮含量、總蛋白含量及3種不同極性浸出物含量與參考序列的關聯系數均較高。因此，確定與原藥材保持質量一致性的葵花盤“精準飲片”的最優加工炮制一體化工藝為葵花盤鮮品切塊、60 ℃烘干。

2.5.4 偏于抗痛風治療的葵花盤“精準飲片”一體化工藝優化 以“2.4”項下測得的總蛋白含量最高值5.63%、水溶性浸出物含量最高值56.05%為理想樣本序列，將K2～K10樣品的相應指標代入“2.5.1”項下各公式計算，結果見表7～表9。

根據各指標的關聯系數計算關聯度并對其進行排序，見表10。由表9、表10可知，陰干塊狀飲片（K6）與理想樣本序列的關聯度最大。因此，確定偏于抗痛風治療的葵花盤“精準飲片”的最優加工炮制一體化工藝為葵花盤鮮品切塊、陰干。

2.5.5 偏于平肝止痛的葵花盤“精準飲片”一體化工藝優化 以“2.4”項下測得的總黃酮含量最高值2.82%、稀乙醇浸出物含量最高值59.24%、乙酸乙酯浸出物含量最高值5.56%為理想樣本序列，將K2～K10樣品的相應指標代入“2.5.1”項下各公式計算，結果見表11～表13。

根據各指標的關聯系數計算關聯度并對其進行排序，見表14。由表13、表14可知，60 ℃烘干塊狀飲片（K4）與理想樣本序列的關聯度最大。因此，確定偏于平肝止痛的葵花盤“精準飲片”的最優加工炮制一體化工藝為葵花盤鮮品切塊、60 ℃烘干。

3 討論

辨證施治是中醫臨床用藥的特點，本課題組結合現代醫學“精準醫療”的理念，提出“精準炮制”研究思路，即根據飲片的臨床應用需要，選擇與功效相關的關鍵活性成分為指標優化加工炮制一體化工藝，制備專用于某一臨床需要的“精準飲片”，實現個性化炮制。本研究分別制備與原藥材保持質量一致性、偏于抗痛風治療或平肝止痛等3種滿足不同需要的“精準飲片”，同時解決葵花盤傳統炮制工藝的弊端，對于每種“精準飲片”的加工炮制一體化工藝進行優化，并運用灰色關聯度法進行建模，以優化葵花盤的炮制工藝。

研究結果顯示，大部分烘干樣品的總黃酮和總蛋白含量均低于陰干樣品，且兩者含量隨干燥溫度增加而升高，當采用60 ℃烘干時樣品中兩者含量最高，超過此溫度進行烘干時兩者含量反而下降。筆者推測，這可能與干燥溫度過高導致黃酮類成分分解、大分子蛋白變性有關。灰色關聯度分析結果顯示，與原藥材保持質量一致性和偏于平肝止痛的葵花盤“精準飲片”的優化一體化工藝為切塊、60 ℃烘干;偏于抗痛風治療的葵花盤“精準飲片”的優化一體化工藝為切塊、陰干。

綜上所述，基于精準醫學的理念，可針對性地按不同需要對葵花盤采用不同的一體化“精準炮制”工藝，但本研究僅以中藥活性成分含量等為指標進行“精準炮制”存在一定局限性。后續擬以此為基礎結合藥效學研究，制備出更能體現中醫精準治療特點的飲片。

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（收稿日期：2019-06-22 修回日期：2019-11-02）

（編輯：段思怡）