油果制作過程中糯米粉發酵對淀粉精細結構的影響

夏月勝，楊麗萍，曹川，許莉，韋冬梅，隋棠，周裔彬

(安徽農業大學，安徽省農產品加工工程實驗室，安徽 合肥，230036)

油果是我國民間的一種以糯米為原料的傳統油炸膨化小吃，口感酥脆，外黃內白，內部呈均勻的蜂窩結構。油果的傳統加工方式為長時間自然發酵糯米，發酵時間長，發酵過程中會產生刺鼻的臭味，而通過酵母菌發酵糯米粉能夠縮短糯米油果的生產周期，改善油果的食用品質。淀粉作為谷物的主要成分，其結構的變化直接影響著產品的品質，研究淀粉結構的變化對改善以淀粉為基質的谷物類食品的品質有著重要意義[1]。近年來國內外有很多關于谷物發酵對淀粉結構影響方面的報道，高粱中的淀粉經自然發酵后持水性和溶解性增加，但透明度降低，糊化溫度降低，糊化焓增加，淀粉的回升值與最終黏度隨發酵時間的延長先減小后增大[2]；乳酸菌發酵使大米粉中的淀粉的保水力、溶解度、凝膠的體積膨脹率均有所增加，顆粒表面遭到侵蝕，小顆粒數目增多，峰值黏度下降，糊化焓升高，結晶度有所降低[3]；利用篩選出的自然菌種發酵小米，研究發現，發酵未改變淀粉的偏光十字，其淀粉顆粒表面遭到侵蝕，孔洞增多，官能團峰位未變但是強度減弱，短期抗老化性能提升[4]；釀酒酵母發酵使玉米淀粉顆粒表面產生孔洞，結晶度先升高后降低，短程雙螺旋有序結構未受影響，糊化溫度和糊化焓均先升高后降低[5]；酵母菌發酵糙米粉能夠使其蛋白質、總灰分、不溶性纖維、可溶性纖維等成分的百分含量升高，降低其溶脹度、水溶性、崩解值、回升值[6]。然而，發酵對糯米粉中淀粉結構的影響尚未見報道。

本文從鏈長分布、表觀結構、短程有序結構、晶體結構、球晶結構、粒徑大小、表觀結構來分析研究糯米粉經酵母菌發酵過程中淀粉結構的變化，從而對糯米油果的生產和糯米發酵的精深加工提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

糯米：蚌埠兄弟糧油有限公司；酵母：安琪酵母股份有限公司；其他化學試劑：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Sirion200掃描電子顯微鏡，日本日立高新技術公司；Rigaku TTR-Ⅲ X射線衍射儀，理學電機公司；IS50FT-IR光譜儀，美國尼高力儀器公司；Mastersizer3000激光粒度儀，英國馬爾文儀器有限公司；ICS-5000高效陰離子(DionexTMCarboPacTMPA200柱(1 mm×250 mm×5.5 μm))，美國賽默飛世爾科技公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 糯米粉發酵及淀粉制備

取500 g糯米粉，接種3%(質量分數)的酵母菌菌液，加一定量的水，揉成面團狀，置于醒發箱中37 ℃發酵0～48 h。淀粉的提取方法參照LI等[7]的方法，用稀堿浸泡分離純化發酵不同時間的糯米淀粉。

1.3.2 發酵對淀粉鏈長分布的影響

采用Dionex ICS-5000 HPAEC的儀器，配備電化學檢測器來測定不同發酵時間的糯米淀粉的鏈長分布。稱取5 mg純化干燥的淀粉，加5 mL雙蒸水，沸水浴60 min，間斷混勻；然后取2.5 mL糊化的樣品，加入125 μL CH3COONa，25 μL NaN3和5 μL異淀粉酶，38 ℃放置24 h。加入375 μL NaBH4，室溫放置24 h。取600 μL于離心管中，室溫干燥，然后溶于600 μL流動相中，離心(12 000 r/min,10 min)，取上清上樣。流動相為：A相：雙蒸水; B相：100 mmol/L NaOH; C相：100 mmol/L NaOH-500 mmol/L NaAC;流速：0.5 mL/min[8]。

1.3.3 發酵對淀粉短程有序結構的影響

淀粉置于瑪瑙研缽中加入無水KBr(1∶100, g∶g)研磨成粉末狀，再用壓片機將其壓成薄的圓片狀。紅外光譜掃描模式設為ATR模式，掃描范圍為4 000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1[9]。

1.3.4 發酵對淀粉結晶結構的影響

淀粉的結晶結構由TTR-Ⅲ X射線衍射儀測定。在40 kV和80 mA下運行，衍射角(2θ)掃描范圍為5°～50°，步長為0.02°。遵循LOPEZ-RUBIO等[10]的方法利用PeakFit軟件(版本4.12, Systat Software Inc., SanJose, CA, USA)計算出結晶度(即結晶區的峰面積和非結晶區的面積的比值)[11]。

1.3.5 發酵對淀粉球晶結構的影響

將淀粉配制成10 g/L的淀粉懸浮液，混合均勻，然后吸取少量滴在載玻片上，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察[12]。

1.3.6 發酵對糯米淀粉粒徑大小的影響

淀粉的粒徑用激光散射儀進行分析，首先用純水作為分散介質，大燒杯作為容器，將淀粉顆粒用小藥

匙緩慢加入到大燒杯至檢測器檢測到6%左右，然后進行粒度檢測，監測范圍為0.02～2 000 μm，記錄對應的直徑D(0.1)、D(0.5)、D(0.9)[13]。

1.3.7 發酵對糯米淀粉表觀結構的影響

將淀粉均勻地涂抹在透明的雙面膠帶上，然后使用離子濺射鍍膜儀在其表面進行鍍金，再置于掃描電鏡下觀察，找具有代表性的區域觀察淀粉表面結構，放大倍數為2 000倍。

2 結果與分析

2.1 發酵對淀粉鏈長分布的影響

基于鏈長的聚合度(DP)，支鏈淀粉的分支分為 4種類型，即A鏈(DP≤12)、B1鏈(DP 13～24)、B2鏈(DP 25～36) 和B3鏈(DP≥37)[14]。圖1顯示，鏈長分布結果發現，隨著發酵時間的延長，發酵12、24、48 h的A鏈的比例較未發酵的分別降低了0.97%、10.02%、 8.51%，而B1鏈的比例較未發酵的分別上升了3.19%、5.25%、6.32%，B2鏈的比例較未發酵的分別升高了1.49%、2.56%、1.30%，B3鏈的比例與未發酵的相比分別增加了0.72%、5.65%、4.33%。由此可得，發酵前期支鏈淀粉A鏈(DP≤12)的比例降低，而使支鏈淀粉B鏈(DP>12)的比例升高，發酵后期支鏈淀粉B2鏈和B3鏈的水解，使得長支鏈淀粉的比例降低。這可能是由于發酵過程中，酵母菌產生的酶和酸等先作用于支鏈淀粉外側的非還原性末端，使其短支鏈淀粉水解，從而長支鏈淀粉的相對含量增加[15]，而在發酵后期，發酵產生的酸和酶等又使得支鏈淀粉的長支鏈發生水解，從而長支鏈淀粉的含量又略有下降[16]。

A-0 h;B-12 h;C-24 h;D-48 h圖1 不同發酵時間糯米淀粉的鏈長分布Fig.1 Distribution of chain length of waxy rice starch during different fermentation time

2.2 發酵對糯米淀粉結晶度的影響

X-衍射可以反映淀粉的晶體特性，如圖2所示，原淀粉與發酵糯米淀粉都是由彌散衍射峰組成，在2θ=15°、17°、18°、23°附近出現特征衍射峰，是典型的谷物類A型晶體，說明發酵并未改變淀粉的結晶結構。通過計算，發酵后淀粉的結晶度(無定形區與結晶區的比值)先增大，12 h最高達到28.55%，這主要是由于發酵前期，酵母菌產生的酶及酸等破壞了淀粉顆粒的無定形區，而后隨發酵時間的延長結晶度逐漸減小，與發酵12 h相比分別降低了4.72%、6.97%， 這是由于發酵后期酶和酸滲透到顆粒內部，侵蝕淀粉顆粒的結晶區，從而使得結晶區的相對面積減少，結晶度降低[5]。

圖2 不同發酵時間糯米淀粉的X-衍射圖譜Fig.2 X-diffraction pattern of waxy rice starch during different fermentation time

2.3 發酵對淀粉短程有序結構的影響

觀察圖3的ATR-FTIR紅外光譜不難發現，在400 cm-1～4 000 cm-1它們的峰位置保持不變，說明在發酵過程中糯米淀粉無新的官能團產生，經過去卷積處理后，在1 047 cm-1和1 022 cm-1處分別對應結晶區和無定形區結構，(比值強度1 047 cm-1/1 022 cm-1) 強度，用來解釋淀粉的雙螺旋有序結構的含量。

圖3 不同發酵時間糯米淀粉的FTIR圖譜Fig.3 FTIR map of waxy rice starch during different fermentation time

通過計算發現，與未發酵的相比在12 h其比值，上升了0.025 7，在發酵24和48 h后(比值1 047 cm-1/1 022 cm-1)降低，較發酵12 h分別降低了0.015、0.024 5。這與X-衍射的結果變化一致，說明了發酵使淀粉的有序結構遭到了一定的破壞。發酵前期，淀粉的非晶區域遭到水解，使得淀粉朝著有序結構改變，而發酵后期，結晶結構遭到破壞，使得淀粉有序結構面積減少，比值降低[7]。

2.4 發酵對淀粉球晶結構的影響

淀粉顆粒內部存在結晶區和無定形區，在結晶區區域中淀粉分子排列高度有序，而在無定形區域淀粉分子排列呈無序狀態，這也導致了這兩種結構密度及折射率存在差異，偏振光通過時會產生明顯的偏光十字[17]。

由圖4可以看出在偏振光下，發酵不同時間的淀粉都具有明顯的偏光十字，證明發酵使其球晶結構無顯著性變化，說明淀粉的結晶區被破壞得較弱，可能是由于發酵產生的酸和酶等主要作用于淀粉的無定形區，對其結晶區的影響較小[18]。

A-0 h；B-12 h；C-24 h；D-48 h圖4 不同發酵時間的淀粉的偏光十字Fig.4 Different fermentation time of waxy rice starch granules on the morphology

2.5 發酵對糯米淀粉粒徑大小的影響

由圖5可知，原糯米淀粉有3個粒徑分布峰，在經過發酵處理后粒徑大小在100 μm處的分布峰消失，同時，隨著發酵時間的延長，粒徑大小在1、10 μm的淀粉比例逐漸增多，在1 μm處發酵24和48 h差別不明顯。這是由于淀粉的無定形區遭到水解，大顆粒淀粉變成小顆粒淀粉，粒徑減小；在發酵后期，顆粒淀粉水解粒徑主要集中在10 μm。這與李麗[19]在研究自然發酵對黃米淀粉的粒徑大小中發現發酵對淀粉的粒徑并未產生影響的結果相反，這主要是由于它們的發酵體系不同，自然發酵和酵母菌發酵優勢菌種不同，菌的產酶產酸能力也不同。

圖5 不同發酵時間糯米淀粉的粒徑分布Fig.5 Size distribution of waxy rice starch at different fermentation times

2.6 發酵對糯米淀粉表觀結構的影響

未發酵與發酵不同時間的糯米淀粉的表觀結構如圖6所示，未發酵糯米淀粉顆粒呈不規則的多面體結構，菱角表面光滑。經發酵過的淀粉與原淀粉有明顯的差別，其表面有明顯的的孔洞，并且隨著發酵時間的延長淀粉顆粒表面的孔洞增多，LU等[20]在研究自然發酵對米粉的影響中有相似的結果，這主要是因為發酵過程中產生的酸和酶等對淀粉的水解作用，淀粉顆粒內部的直鏈淀粉被溶出[15]。

A-0 h；B-12 h；C-24 h；D-48 h圖6 不同發酵時間淀粉的顆粒形態Fig.6 Different fermentation time of waxy rice starch granules on the morphology

3 結論

通過對糯米粉發酵過程中的淀粉進行提取，與未發酵的糯米淀粉作比較，探討酵母菌發酵對糯米粉中淀粉結構的變化規律。研究發現,發酵能夠促進支鏈淀粉中短鏈的分解；發酵并未形成新的官能團，但使淀粉的短程有序結構發生變化，發酵12 h前朝著有序的方向改變，發酵12 h后朝著無序的方向發展；它的晶型并未改變，但是結晶度發生了變化，其結晶度先升高后降低；粒徑分析發現，發酵使淀粉顆粒粒徑逐漸減小；淀粉的球晶結構變化不是特別顯著，但淀粉的表面遭到侵蝕產生諸多孔洞。本研究從不同角度研究糯米粉發酵對淀粉結構的影響。綜合上述結果，酵母菌發酵使糯米淀粉的結構發生了明顯的變化，本文闡明了糯米粉發酵對淀粉的改性作用機理，有助于促進糯米粉相關發酵產品的研發，提高糯米粉的應用價值與經濟效益。