枯草芽孢桿菌發酵玉米肽供體的篩選

劉 奇,張 智

(東北林業大學林學院,黑龍江哈爾濱 150040)

玉米肽(Corn Peptide,CP)是一種由氨基酸通過肽鍵以不同的連接方式而形成的具有特定空間結構和功能活性的短肽聚合物[1-2]。研究表明CP具有抑制血管緊張素轉換酶[3]、降低血壓[4]、促進乙醇代謝、醒酒護肝[5]以及抗氧化[6-8]、緩解疲勞[9]、抗癌[10]等功能。張智等[11]以CP為參照研究玉米肽鋅(CP-Zn)螯合物的結構表征和體內抗氧化活性變化,結果表明CP-Zn的抗氧化活性優于CP,且能顯著降低小鼠血清、肝臟中丙二醛含量,提高超氧化物歧化酶的活力。

目前常用的制備玉米肽螯合物的方法有酶解法、微生物發酵法和化學合成法[12]。枯草芽孢桿菌發酵制備玉米肽螯合物是利用微生物發酵產生的胞外酶將供體鑲嵌在兩個肽分子之間形成一種穩定的連接形式,可以提高CP功能活性的同時改善其適口性[13],降低肽的苦味和抗營養因子含量。目前我國利用CP制備玉米肽-葡萄糖(CP-G)并研究其體內體外抗氧化活性的研究相對較少。為充分開發利用CP,提高玉米副產物附加值,本研究以CP為底物,通過添加酸類、糖類和金屬離子等供體,利用枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)ls-45為發酵菌種,以DPPH轉化率為指標進行供體的篩選和體內抗氧化活性的研究,為后續探討CP修飾產物細胞免疫功能試驗等提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

種子培養基(葡萄糖0.5%、酵母膏1%、蛋白胨0.5%、氯化鈉0.2%) 本實驗室自制;雄性SPF小鼠(體重為(20±2) g,合格證號:SCXK黑2013-004) 由黑龍江省中醫藥大學藥物評價中心提供;CP 齊齊哈爾大學食品與生物工程學院提供;枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)ls-45 東北林業大學食品微生物實驗室保藏;蛋白胨、酵母膏、乳糖、半乳糖、甘露糖、果糖、葡萄糖 北京華美生科生物技術有限公司;DPPH、琥珀酸酐、乙二胺四乙酸(EDTA)、乙酸酐、乙酸、草酸、硫酸鐵、硫酸銅、硫酸鎂、硫酸鋅、硫酸錳、硫酸鈣 上海浩洋生物技術有限公司;超氧化物歧化酶(SOD)測試盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測試盒、丙二醛(MDA)測試盒 蘇州卡爾文生物技術有限公司。

722S可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司;TU-1810紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限公司;5030-PVL程控壓力蒸汽滅菌器 長春百奧生物儀器有限責任公司;SW-CJ-IFD超凈臺 蘇州安泰空氣技術有限公司;AR2140型分析天平、S220型pH計 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司;ZD-85雙功能氣浴恒溫振蕩器 江蘇金怡儀器科技有限公司;TgL16B型臺式離心機 上海安亭科學儀器廠制造;Dgg-9053A型電熱鼓風干燥箱 上海森信實驗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 枯草芽孢桿菌發酵CP供體修飾方法 通過Sephadex G-25分級得到CP段,其平均分子質量為572 Da,肽含量為75.83%,將CP段配制成底物濃度為4%的溶液,調節pH至7;取50 mL CP溶液,按CP與不同供體(見表1)體積比為10∶1的比例加入供體,再次調節pH至7;121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min,冷卻至室溫(20 ℃);在無菌條件下接入枯草芽孢桿菌菌液進行發酵,枯草芽孢桿菌接種量4%,發酵時間48 h;得到的發酵液再次滅菌,冷卻后4500 r/min離心10 min;流水透析24 h,過濾后冷凍干燥得到最終修飾產物[11]。

表1 各類修飾供體選擇Table 1 Selection of different modified donors

1.2.2 枯草芽孢桿菌發酵CP供體篩選 以枯草芽孢桿菌為菌種發酵,利用酸類的酰基化、糖類的糖基化和金屬離子的螯合作用分別對CP進行修飾,以產物DPPH·清除能力為依據,轉化率為指標進行CP供體體外抗氧化能力的篩選。

1.2.2.1 CP修飾產物DPPH·清除能力的測定 將1.2.2制得的CP修飾產物配制成3 mg/mL的乙醇溶液備用。用95%的乙醇溶解DPPH粉末,配成0.2 mmoL/L的DPPH溶液。取待測樣品溶液和DPPH各2 mL混勻,室溫(20±2) ℃下避光放置30 min后,于517 nm處測吸光度值,記為OD1;對照組用95%的乙醇代替DPPH溶液,同樣條件下室溫避光放置30 min后,于517 nm處測吸光度值,記為OD2;空白組用蒸餾水代替樣液,于517 nm處測定吸光值,記為OD0。

式(1)

式中:OD1為樣液加DPPH溶液的吸光度值;OD2為樣液加乙醇溶液的吸光度值;OD0為乙醇加DPPH溶液的吸光度值。

1.2.2.2 CP修飾產物DPPH·轉化率的測定 利用酸類、糖類和金屬離子對CP進行修飾,得到修飾產物的DPPH·轉化率,并與CP的DPPH·轉化率進行比較,得出DPPH·清除率提高的百分比,即轉化率。

式(2)

式中:A為修飾產物的DPPH·清除率;A0為CP的DPPH·轉化率。

1.2.3 CP修飾供體比例的確定 按CP與供體投料質量比1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、8∶1和10∶1加入篩選后的供體,其余過程采用1.2.1 微生物法CP供體修飾方法,最終以產物的轉化率為評價指標,考察投料比對修飾產物DPPH轉化率的影響,從而確定最佳供體比例,轉化率計算見式(2)。

1.2.4 動物實驗模型建立與飼養 健康雄性SPF小鼠適應性飼養7 d后,稱量小鼠體重,將小鼠按照體重指標隨機分為7組,每組12只,采用基礎飼料飼喂,自由飲水,室溫環境(20±2) ℃,相對濕度45%±3%,光照12 h/d。空白組采用生理鹽水灌胃,各組均每天上午9時灌胃,連續灌胃給藥30 d。給藥劑量根據《保健食品功能學評價程序和檢驗方法-2003》擬定[14],實驗分組見表2。

表2 功能實驗分組 Table 2 Groups of function test

1.2.5 抗氧化酶活性的測定 末次灌胃給藥并禁食24 h后,稱量實驗小鼠體重并記錄,處死實驗小鼠后,摘取脾臟、胸腺,利用氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒測定小鼠血清和肝臟組織勻漿中超氧化物歧化酶(SOD)活性和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性水平。

1.3 統計學分析

數據采用SPSS 20統計學軟件進行比較分析,p<0.05差異顯著,p<0.01差異極顯著,Origin軟件繪制相關圖表。

2 結果與分析

2.1 CP修飾供體篩選

由圖1～圖3可知,利用枯草芽孢桿菌發酵CP供體的修飾結果中,酸類、糖類和金屬離子修飾后產物的DPPH·轉化率都大幅度提高。從酸類供體修飾效果來看,乙酸酐>檸檬酸>琥珀酸酐>草酸>乙酸>EDTA,乙酸酐DPPH·轉化率達到65.95%,修飾效果最好;從糖類供體修飾效果來看,葡萄糖>乳糖>半乳糖>甘露糖>果糖,修飾供體葡萄糖的DPPH·轉化率達到79.95%,是所有修飾供體中效果最佳的;從金屬離子類供體修飾效果來看,Fe2+>Mg2+>Cu2+>Mn2+>Ca2+>Zn2+,其中經Fe2+修飾后的DPPH轉化率達到78.26%。綜合圖1～圖3可知,三類供體對C修飾效果整體表現為:糖類>酸類>金屬離子,因此本研究選取葡萄糖作為CP修飾的最佳供體。

圖1 酸類供體篩選Fig.1 Screening the modified donors from acid groups注:不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)；圖2、圖3同。

圖2 糖類供體篩選Fig.2 Screening the modified donor from saccharides groups

圖3 金屬離子供體篩選Fig.3 Screening the modified donor from metal ion groups

2.2 CP修飾供體比例的確定

由圖4可以看出,隨著CP與葡萄糖供體投料比的增加,即供體所占比例減少時,轉化率整體呈先上升后平緩的趨勢,這說明投料比對CP的DPPH轉化率有一定影響。在投料比為8∶1時,轉化率達到79.84%,因此從實際生產的角度考慮本研究選擇投料比為8∶1作為CP與葡萄糖的最佳配比。

圖4 葡萄糖比例的確定Fig.4 Determination of proportion of donors to glucose

2.3 小鼠體內抗氧化活性實驗結果

2.3.1 血清、肝臟中SOD活性 CP和CP-G對小鼠血清、肝臟中SOD活性的影響見圖5。SOD是體內重要的抗氧化酶,能有效清除氧自由基,降低或阻止其對機體細胞和組織的損害[15]。超氧化物歧化酶對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關重要的作用,超氧化物歧化酶能清除機體內氧自由基,抑制脂質過氧化反應,保護細胞免受自由基損傷。由圖5可知,與正常組相比CP中、高劑量組和CP-G低、中、高劑量組均顯著(p<0.05)提高血清和肝臟中的SOD活性。

圖5 CP、CP-G對小鼠血清、肝臟中SOD活性的影響Fig.5 Influence of CP、CP-G on activity of SOD in serum and liver of mice注:不同大寫字母表示各組血清指標差異顯著(p<0.05), 不同小寫字母表示各組肝臟指標差異顯著(p<0.05)；圖6同。

2.3.2 血清、肝臟中GSH-Px活性 CP和CP-G對小鼠血清、肝臟中GSH-Px活性的影響見圖6。谷胱甘肽(GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的一種三肽,是甘油醛磷酸脫氫酶的輔基,又是乙二醛酶及磷酸丙糖脫氫酶的輔酶。而GSH-Px是機體廣泛存在的一種重要的催化過氧化氫分解的酶,它能特異催化還原型谷胱甘肽過氧化氫進行還原反應,清除體內低分子自由基、過氧化氫和脂質過氧化物等,進而起到保護細胞膜結構和功能完整的作用,減少氧自由基對機體細胞或組織的損傷[16]。因此血清和肝臟中SOD和GSH-Px是評價機體抗氧化應激能力的重要指標[17]。由圖6可知,與正常組相比,CP和CP-G低、中、高劑量組均顯著(p<0.05)提高血清中的GSH-Px活性;CP低、中、高劑量組,CP-G中、高劑量組均顯著(p<0.05)提高肝臟中的GSH-Px活性。

圖6 CP、CP-G對小鼠血清、肝臟中GSH-Px活性的影響Fig.6 Influence of CP、CP-G on activity of GSH-Px in serum and liver of mice

3 結論

枯草芽孢桿菌發酵三類供體,分別為酸類(琥珀酸酐、乙二胺四乙酸(EDTA)、乙酸酐、乙酸、檸檬酸、草酸)、糖類(葡萄糖、乳糖、半乳糖、甘露糖、果糖)和金屬離子(硫酸鐵、硫酸銅、硫酸鎂、硫酸鋅、硫酸錳、硫酸鈣),得到的CP修飾供體整體抗氧化效果為:糖類>酸類>金屬離子,經篩選CP的最佳修飾供體為葡萄糖,當投料比為8∶1時,DPPH轉化率達到79.84%。體內抗氧化實驗表明,同對照組相比CP中、高劑量組和CP-G低、中、高劑量組均顯著(p<0.05)提高血清和肝臟中的SOD活性;CP和CP-G低、中、高劑量組均顯著(p<0.05)提高血清中的GSH-Px活性;CP低、中、高劑量組和CP-G中、高劑量組均顯著(p<0.05)提高肝臟中的GSH-Px活性。由此說明CP-G較CP而言可以更有效提高體內SOD和GSH-Px含量,增強機體的自由基清除能力。本文為后續研究CP-G修飾產物細胞免疫機制提供理論及數據支持。