高效降膽固醇降甘油三酯乳酸菌的分離鑒定和功能分析

吳慧昊,牛 鋒,鐘 琦,楊 迪

(1.西北民族大學(xué)實驗中心,甘肅蘭州 730030;2.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730030;3.湖北省當(dāng)陽市動物疫病預(yù)防控制中心,湖北當(dāng)陽 444100)

膽固醇是人體必需的營養(yǎng)成分,在體內(nèi)承擔(dān)著重要的生理功能,然而人體血清中膽固醇含量往往過高,血清膽固醇過高所造成的一系列心血管疾病嚴(yán)重影響人類健康,現(xiàn)代研究已發(fā)現(xiàn),動脈粥樣硬化、靜脈血栓形成與高膽固醇血癥有密切的相關(guān)性[1-5]。WTO預(yù)測,到2030年心血管疾病將是導(dǎo)致死亡的主要原因,影響全世界約2.36億人們的健康。據(jù)報道,西歐國家和東歐國家的心臟病發(fā)生是由血膽固醇過多造成[6]。與正常血脂水平人群相比,高血脂人群具有高出3倍的心臟病誘發(fā)風(fēng)險。甘油三酯(Triglyceride,TG)是人體內(nèi)含量最多的脂類,大部分組織均可以利用甘油三酯分解產(chǎn)物供給能量。但如果甘油三酯過量,則可造成動脈硬化、冠心病、心梗、腦卒等[7-8]。

目前,主要通過他汀類藥物控制高血脂癥,但該種藥物具有嚴(yán)重的毒副作用,容易造成肌痛、頭痛、胃腸不適、肝腎功能損害等副作用[9-11]。他汀類藥物的較嚴(yán)重的不良反應(yīng)之一是橫紋肌溶解[12-13]。西立伐他汀(拜斯亭)由于嚴(yán)重的致橫紋肌溶解及腎衰竭,于2001年8月在世界范圍內(nèi)收回,它已導(dǎo)致美國及歐洲部分地區(qū)52例病人死亡的事故[14]。

益生菌作為“有生命的綠色藥品” 已被研究證明具有優(yōu)效、安全、符合生態(tài)等諸多優(yōu)點,已被越來越多的應(yīng)用于人類疾病的各個領(lǐng)域[15-17]。科學(xué)家先后通過對常飲酸乳人群的調(diào)查以及直接對酸乳的研究等發(fā)現(xiàn),乳酸菌具有降低人體血清膽固醇的作用。本研究從6種乳制品樣品中篩選出具有降膽固醇、降甘油三酯,同時具有抑制有害菌生長功能的乳酸菌,將其應(yīng)用于新型藥物、保健食品的制備,對保護人體健康具有重要的現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

6種樣品 來自于蘭州漿水、新疆奶酪、瑪曲酸奶、澤庫酸奶、蘭州腌菜、藏獒腸道處,并于低溫冰箱厭氧保存?zhèn)溆?枯草芽孢桿菌(實驗室前期分純菌株)、大腸桿菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC25923 保存于實驗中心厭氧微生物實驗室;SPF級昆明雌性小白鼠 8周齡,體重在20～22 g,由蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物飼養(yǎng)中心提供;MRS固/液體培養(yǎng)基 配制方法見文獻(xiàn)[18]；高膽固醇MRSO-CHOL培養(yǎng)基 準(zhǔn)確稱量膽固醇0.1 g放入小燒杯中,加入0.2 g牛膽鹽、0.1 g蔗糖酯、1 mL吐溫80攪拌均勻,再移取5 mL的冰乙酸加熱溶解,用超聲波處理15 min后,快速加入到配制好的MRS液體培養(yǎng)基中,邊加入邊攪拌,使其形成均勻穩(wěn)定的膠體溶液。

MLS-3750全自動高壓滅菌器 日本三洋貿(mào)易株式會社;TU-1900雙光束紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;GL-21M高速冷凍離心機 賽特湘儀離心機儀器有限公司;PB-10 pH儀 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;BX51T-32P01 數(shù)碼光學(xué)顯微鏡 日本奧林巴斯株式會社;1285 生物安全柜 美國熱電公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種的分離、純化 從蘭州漿水、新疆奶酪、瑪曲酸奶、澤庫酸奶、蘭州腌菜、藏獒腸道內(nèi)溶物等6種樣品中,分別稱取0.5 g加入到裝有4.5 mL無菌水的試管中,逐次稀釋至10-6,取10-4、10-5、10-6三管稀釋液各0.1 mL,涂布于MRS固體培養(yǎng)基,37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h進行分離。挑取菌落,連續(xù)劃線分離純化,經(jīng)鏡檢確認(rèn)為純種后,置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 降膽固醇乳酸菌初篩 無菌條件下,于滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中加入3%雞蛋黃作為膽固醇源,無菌均勻分裝到三角瓶中。以2%(菌體濃度為108cfu/mL)的接菌量加入菌液,37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h,在8000 r/min下離心10 min,取上清液測定其中膽固醇含量[19]。每組實驗設(shè)定3個重復(fù)。

膽固醇降解率按照以下公式計算:

膽固醇降解率(%)=(C-A)×100/C

式中:A為菌株發(fā)酵后培養(yǎng)液在560 nm處的OD值;C為對照在560 nm處的OD值。

1.2.3 降膽固醇乳酸菌復(fù)篩 將初篩降解率較高的菌株以2%(菌體濃度為108cfu/mL)的接菌量接種于高膽固醇MRSO-CHOL培養(yǎng)基中,37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h,在8000 r/min下離心10 min,取上清液按照磷硫鐵比色法[19],測定上清液中膽固醇含量,計算膽固醇降解率。

1.2.4 菌株對甘油三酯的降解 無菌條件下,于滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中加入2%的甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)品,無菌分裝到三角瓶中。以2%(菌體濃度為108cfu/mL)的接菌量加入菌液(未接菌的試管作為空白對照),37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h,于420 nm處測定甘油三酯降解率[20]。

甘油三酯降解率(%)=(C-A)×100/C

式中:A為菌株發(fā)酵后培養(yǎng)液在420 nm處的OD值;C為空白對照在420 nm處的OD值。

1.2.5 菌株耐酸實驗 將菌株活化后制成菌懸液(菌體濃度為108cfu/mL),將不同菌株分別接種于pH6.8、pH3.0、pH2.0的液體培養(yǎng)基中,37 ℃恒溫培養(yǎng)10 h,利用梯度稀釋平板法測定活菌數(shù),做5個平行求平均值。以菌株名稱為橫坐標(biāo),單位菌落總數(shù)對數(shù)值為縱坐標(biāo)繪圖。

1.2.6 菌株對0.3%膽鹽環(huán)境的耐受力測定 將菌株活化后制成菌懸液(菌體濃度為108cfu/mL),按2%的接種量分別接種于含0.0%(空白)、0.3%牛膽鹽的復(fù)合液體培養(yǎng)基中。37 ℃培養(yǎng)24 h后,分別測定其OD值,做3個以上平行求平均值,按下述公式計算菌株對膽鹽的耐受力。

膽鹽耐受力(%)=含膽鹽培養(yǎng)基的OD×100/空白培養(yǎng)基的OD

1.2.7 抑菌試驗 取活化好的枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌分別接種于營養(yǎng)肉湯中,37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h,用無菌水稀釋至108cfu/mL,備用。活化待測菌株,采用牛津杯法進行抑菌試驗[21],每個指示菌做兩個平皿,測抑菌圈直徑,求平均值,空白對照組采用無菌水進行實驗。

1.2.8 小鼠體內(nèi)毒性試驗 將20只小鼠隨機分成2組,A組灌胃生理鹽水,B組灌胃3株乳酸菌混合菌懸液(1∶1∶1)。A組小鼠每只每天灌胃生理鹽水0.5 mL,B組小鼠每只每天灌胃含1×108個乳酸菌的混合懸浮液0.5 mL。為了保證菌體溶液中一定的活菌數(shù),每次灌胃都采用新鮮處理的菌株。自由進水,每周記錄體重。在給藥42 d后,處死解剖,將心臟、肝臟、脾臟、腎臟、肺取出用生理鹽水沖洗并擦拭干凈后稱重,進行臟器指數(shù)的測定[22],觀察臟器是否發(fā)生病變。

臟器指數(shù)(%)=臟器質(zhì)量×100/體重

1.2.9 菌株生理生化及分子鑒定 分離菌株主要通過碳源利用試驗、氮源利用試驗、產(chǎn)酸試驗、運動性檢查等生理生化特征進行鑒定。采用16S rDNA法對所分純的菌株進行分子鑒定。16S rDNA擴增及序列測定方法參照文獻(xiàn)[23]。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction)產(chǎn)物測序由寶生物工程(大連)有限公司完成。測序完成提交菌株的16S rDNA序列在NCBI(National Center for Biotechnology Information,美國國立生物技術(shù)信息中心)數(shù)據(jù)庫中進行比對,MEGA軟件分析,采用Neighbor-Joining構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,Bootstrap 1000次進行穩(wěn)定性驗證。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本研究的數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(Mean±SD),采用Microsoft Excel 2007處理數(shù)據(jù),應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計分析數(shù)據(jù),采用MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離、純化結(jié)果

從采集的6種樣品中共分離得到17株乳酸菌，見表1。分純的17株乳酸菌菌落顏色均為乳白色,直徑約2 mm,表面光滑、邊緣整齊、中央隆起,菌落周圍有明顯的溶鈣圈,乳酸菌鏡檢形態(tài)為短桿狀、單球狀、雙球狀和鏈球狀。

表1 分純?nèi)樗峋鷣碓醇靶螒B(tài)特征Table 1 Source and morphological characteristics of lactic acid bacteria

2.2 降膽固醇菌的初篩結(jié)果

對17株乳酸菌進行降膽固醇能力測試,結(jié)果發(fā)現(xiàn),有11株乳酸菌具有降膽固醇能力,測定結(jié)果見圖1所示。由圖1可以看出,菌株ZL014、ZL016、ZL010、ZL011、ZL012、ZL013、ZL005對于蛋黃中膽固醇的降解率較高,其中菌株ZL010降解率最高,達(dá)到73.65%,后續(xù)實驗選取不同來源菌株中降解率較高的ZL010(蘭州漿水)、ZL016(藏獒腸道)、ZL005(瑪曲酸奶)3株乳酸菌進行研究。

圖1 不同乳酸菌菌株對蛋黃中膽固醇降解率的影響Fig.1 Effect of cholesterol degration rate in egg yolk of different lactic acid bacteria

2.3 降膽固醇菌的復(fù)篩結(jié)果

由圖2可以看出,菌株ZL010對于高純度膽固醇的降解率最高,為40.06%,其余相對較低。

圖2 不同菌株對高純度膽固醇降解率的影響Fig.2 Effect of cholesterol degradation rate of the strains

2.4 菌株對甘油三酯的降解效果

由圖3可以看出,三株乳酸菌對于甘油三酯具有不同的降解能力,其中ZL010最高,降解率達(dá)到5.1%,其余兩株降解率相對較低,ZL005為3.9%,ZL016為2.8%。

圖3 菌株對甘油三酯的降解能力Fig.3 Triglyceride-lowering ability of strains

2.5 復(fù)篩后菌株的耐酸實驗結(jié)果

在37 ℃恒溫培養(yǎng)10 h后,3種菌都呈現(xiàn)了較強的耐酸性,3株菌在pH3.0的條件下存活率都比較高,pH2.0時,菌株的存活率與pH6.8時對比都有所下降,但仍能達(dá)到105cfu/mL(見圖4)。胃中的酸環(huán)境隨飲食結(jié)構(gòu)不同而發(fā)生較大的變化。一般來說,空腹時胃液的pH為0.9～1.8,進食過程中pH為1.8～5.0,通常維持在3.0左右[24]。耐酸實驗表明,菌株具備一定的耐受胃中酸性環(huán)境的能力。

圖4 不同酸度對菌株生長的影響Fig.4 Effects of different acidity on the growth of strains

2.6 菌株對0.3%膽鹽環(huán)境的耐受力測定結(jié)果

由圖5可以看出,菌株ZL005在含0.3%牛膽鹽的培養(yǎng)基中生長基本不受抑制,而菌株ZL010和ZL016在含0.3%牛膽鹽的培養(yǎng)基中生長略受抑制,人體小腸中膽鹽含量在0.03%～0.3%范圍內(nèi)波動,而試驗所選取膽鹽含量為最大濃度,在實際應(yīng)用中將會有更多菌存活。

圖5 膽鹽耐受試驗Fig.5 Tolerance of the strains to bile salts

2.7 抑菌試驗結(jié)果

各菌株對指示菌的抑菌效果見表2所示,菌株ZL005、ZL010、ZL016對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌有不同程度的抑制作用,其中ZL010對三種菌的抑制效果最顯著,ZL016次之，ZL005抑菌效果略低。

表2 菌株對指示菌的抑制作用(直徑，mm)Table 2 Inhibitory effect of the strains(diameter，mm)

2.8 毒性試驗結(jié)果

毒性試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠毛色光潔,食欲、兩便正常,灌胃42 d未出現(xiàn)異常體征,未發(fā)現(xiàn)異常死亡,小鼠體重增長前14 d較快,14 d后趨于平穩(wěn)(見圖6)。小鼠處死解剖后,內(nèi)臟正常,顏色紅潤、光滑,無器質(zhì)性病變,小鼠臟器指數(shù)與對照組相比無顯著差異(p>0.05),結(jié)果表明乳酸菌菌株對小鼠沒有毒副作用(見表3)。

表3 毒性試驗小鼠臟器指數(shù)比較(%)Table 3 Viscera indices of mice(%)

圖6 小鼠體重變化Fig.6 Weight changes in mice

2.9 菌株生理生化鑒定結(jié)果

3株菌革蘭氏染色均為陽性,經(jīng)半固體培養(yǎng)基穿刺培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),菌株沿穿刺線生長,邊緣清晰,無運動性,兼性厭氧。菌株均不還原硝酸鹽,不液化明膠,接觸酶和氧化酶反應(yīng)均為陰性,3株菌具體生理生化鑒定結(jié)果見表4所示。

表4 3株乳酸菌生理生化鑒定結(jié)果Table 4 Physiological identification results

2.10 16S rDNA分子鑒定

測序完成提交菌株的16S rDNA序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行比對,結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株ZL016的基因序列,與戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)的同源性為99.9%,使用Neighbor-Joining構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果顯示,菌株ZL016在系統(tǒng)發(fā)育樹上與Lactobacilluspentosusstrain 124-2在一個分支上(圖7),因此結(jié)合生理生化特征,鑒定菌株ZL016為戊糖乳桿菌。菌株ZL010的基因序列,與植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)的同源性為99.9%,在系統(tǒng)發(fā)育樹上與Lactobacillusplantarumstrain JCM 1149在一個分支上(圖8),因此結(jié)合生理生化特征,鑒定菌株ZL010為植物乳桿菌。菌株ZL005與耐久腸球菌(Enterococcusdurans)的同源性為100%,因此結(jié)合生理生化特征,鑒定菌株ZL005為耐久腸球菌(圖9)。

圖7 ZL016與相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 Phylogenetic tree of ZL016 and related strains

圖8 ZL010與相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.8 Phylogenetic tree of ZL010 and related strains

圖9 ZL005與相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.9 Phylogenetic tree of ZL005 and related strains注:發(fā)育樹節(jié)點的數(shù)字表示Bootstrap值,括號中的數(shù)字為序列登錄號,標(biāo)尺代表進化距離單位。

3 結(jié)論

從6種西北特有樣品中篩選分離出3株具有降膽固醇降甘油三酯能力的乳酸菌,其中菌株ZL010降膽固醇降甘油三酯效果最強,蛋黃中膽固醇的降解率為73.65%,高純度膽固醇降解率為40.06%,甘油三酯降解率為5.1%。3株菌都具有很好的抑菌、耐酸、耐膽鹽能力,菌株經(jīng)生理生化及16S rDNA鑒定為:ZL005為耐久腸球菌(Enterococcusdurans),ZL010為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum),ZL016為戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)。經(jīng)動物體內(nèi)毒性實驗發(fā)現(xiàn),小鼠未出現(xiàn)異常體征,未發(fā)現(xiàn)異常死亡,且解剖觀察各臟器一切正常,無任何病變,證明菌株無毒副作用。因此,菌株可用于降脂降膽固醇保健藥品及功能食品的制備。