玫瑰茄花色苷微膠囊的制備及其穩定性與釋放性的評價

孟翔宇,趙彥巧,李鈺琨,李亞琴,肖 紅,肖 瑤,楊夢龍

(天津商業大學生物技術與食品科學學院,天津市食品生物技術重點實驗室,天津 300134)

玫瑰茄(Hibiscussabdariffa)是一種珍貴的藥食同源植物[1],其花萼含有豐富的花色苷、酚類、氨基酸、有機酸和礦物質等多種營養成分[2]。研究表明,花色苷具有抗氧化、抗腫瘤、保護心腦血管和提高免疫等功效[3-6],但其易受pH、溫度、光照和金屬離子等因素影響而發生降解[7-8],限制了其在食品和醫藥領域的應用。目前,有關玫瑰茄花色苷的提取工藝、性質及用途的研究很多,但是增加玫瑰茄花色苷穩定性的研究較少。

海藻酸鈉是從天然褐藻中提取的一種線性陰離子高分子多糖,其穩定性、增稠性、成膜性和絮凝性良好;殼聚糖是一種天然的堿性直鏈陽離子聚合多糖,生物相容性好,在體內能被多種酶生物降解、無毒、無抗原性。因此,海藻酸鈉和殼聚糖已成為生物醫學等領域廣泛應用的高分子生物材料,是微膠囊采用的理想壁材。當前大多數研究多選用噴霧干燥法制備微膠囊,其方法存在不足:制備條件設置高溫,在最初很容易破壞花色苷結構、操作不便、流速難控制、成本高。銳孔法是指利用注射器或滴管等器具,將充分溶解混勻的壁材和芯材滴加到氯化鈣凝固浴中,使其在固化劑中快速固化形成微膠囊的方法。此項技術操作簡便、制備條件溫和、成本低,屬于環境友好型技術。目前,已有研究采用銳孔法對獼猴桃油[9]、還原型谷胱甘肽[10]和紅棗色素[11]等物質進行微膠囊化。陳虎等[12]對比研究了黑果枸杞中微膠囊化與未微膠囊化花色苷的穩定性與釋放性,結果表明,微膠囊化能有效提高花色苷的性質。梅薇等[13]研究了銳孔法制備玫瑰花花青素的工藝條件,考察壁材濃度和針頭孔徑對工藝的影響,結果表明,制備的玫瑰花花青素微膠囊有很高的包埋率。史同瑞等[14]研究了殼聚糖-海藻酸鈉微膠囊的形成機理及制備方法。前人的理論研究為以后的天然產物微膠囊化研究奠定了基礎,提供了依據。但采用銳孔法制備玫瑰茄花色苷微膠囊的研究以及微膠囊化花色苷的穩定性及釋放性在國內外鮮見報道。

本研究采用銳孔法制備玫瑰茄花色苷微膠囊。并利用紅外光譜儀對花色苷微膠囊進行結構和成分分析;考察不同溫度和光照條件下,微膠囊前后花色苷的穩定性,并對微膠囊化花色苷在模擬人工胃、腸液中釋放效果進行研究,以期提高玫瑰茄花色苷利用率和附加值提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玫瑰茄 云南武定;果膠酶 500 U/mg,上海源葉生物科技有限公司;海藻酸鈉 AR,北京市旭東化工廠;無水氯化鈣 AR,天津市江天化工技術有限公司;殼聚糖(BR,脫乙酰度≥85%) 美國Sigma試劑公司;檸檬酸鈉 AR,天津市瑞金特化學品有限公司;檸檬酸 AR,天津市風船化學試劑科技有限公司;溴化鉀 SP,天津市金貝爾科技有限公司;純水 實驗室自制。

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器廠;UV-2802S型紫外可見光分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司;TENSORⅡ紅外光譜儀 德國布魯克;AX224ZH電子天平 奧豪斯儀器(常州)有限公司;電熱鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司;0～150 mm游標卡尺 杭州華豐巨箭工具有限公司;超聲波清洗器 上海科導超聲儀器有限公司;真空冷凍干燥系統 科儀創智(北京)科技發展有限公司;Milli-Q純水機 美國Millipore。

1.2 實驗方法

1.2.1 玫瑰茄花色苷的制備 將玫瑰茄花萼放置在烘箱內,40 ℃,干燥7 h,將烘干的玫瑰茄花萼粉碎,過40～60目標準篩,獲取玫瑰茄粉。以純水為提取溶劑,在液料比45∶1 mL/g,果膠酶添加量5 mg/g、水浴溫度45 ℃的條件下酶解90 min,得到玫瑰茄花色苷提取液,經濃縮后冷凍干燥得玫瑰茄花色苷粉末[15]。

1.2.2 銳孔法制備玫瑰茄花色苷微膠囊工藝流程

1.2.2.1 海藻酸鈉壁材溶液的配制 稱取一定質量的海藻酸鈉,加入蒸餾水,配制成一定質量分數的海藻酸鈉溶液,備用。

1.2.2.2 芯材花色苷與壁材混合液的配制 根據壁芯比,稱取一定質量的芯材加入壁材溶液中混合,備用。

1.2.2.3 凝固浴的配制 配制一定質量分數的殼聚糖溶液和一定質量分數CaCl2溶液,混合在一起制成凝固浴,備用。

1.2.2.4 花色苷微膠囊的制備 將凝固浴放置在磁力攪拌器上,設溫度為25 ℃,用孔徑為0.5 mm的5 mL注射器將芯壁混合溶液滴至凝固浴中,攪拌包埋30 min,包埋完成后,倒掉凝固浴,將微膠囊表面殘留的凝固浴用純水沖洗干凈,抽濾至微膠囊表面無明顯液體,將微膠囊倒入培養皿,放入烘箱中40 ℃干燥1 h,即得到微膠囊成品。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 不同殼聚糖質量分數對微膠囊包埋率的影響 在海藻酸鈉質量分數為2.0%,CaCl2質量分數為2.0%,壁芯比2∶1 g/g,考察殼聚糖質量分數在0.05%、0.10%、0.15%、0.20%和0.25%時的微膠囊包埋率。

1.2.3.2 不同CaCl2質量分數對微膠囊包埋率的影響 在海藻酸鈉質量分數為2.0%,壁芯比2∶1 g/g,殼聚糖質量分數為0.1%的條件下,考察CaCl2質量分數在1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%時的微膠囊包埋率。

1.2.3.3 不同海藻酸鈉質量分數對微膠囊包埋率的影響 在CaCl2質量分數為2.0%,壁芯比2∶1 g/g,殼聚糖質量分數為0.1%的條件下,考察海藻酸鈉質量分數在1.6%、1.8%、2.0%、2.2%和2.4%時的微膠囊包埋率。

1.2.3.4 不同壁芯比對微膠囊包埋率的影響 在海藻酸鈉質量分數為2.0%,CaCl2質量分數為2.0%,殼聚糖質量分數為0.1%的條件下,考察壁芯比在1.0∶1、1.5∶1、2.0∶1、2.5∶1和3.0∶1 g/g時的微膠囊包埋率。

1.2.4 響應面試驗優化花色苷微膠囊包埋工藝 以海藻酸鈉質量分數(A)、CaCl2質量分數(B)、壁芯比(C)、殼聚糖質量分數(D)為因子,以微膠囊包埋率(Y)為指標,進行響應面優化試驗。響應面試驗因素與水平見表1。

圖1 銳孔法制備微膠囊裝置示意圖Fig.1 Device of microcapsule by Piecing Method

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels used in response surface design

1.2.5 指標的測定

1.2.5.1 花色苷含量的計算

花色苷提取量(mg/100 g)=(ΔA×V×F×M×100)/(ε×1×W)

ΔA=(A520(pH1.0)-A700(pH1.0))-(A520(pH4.5)-A700(pH4.5))

式中:M為矢車菊素葡萄糖苷(Cyanidin-3-glucoside)的分子量,449.2 g/mol;W為樣品質量,g;V為提取液體積,mL;F為稀釋倍數;ε為摩爾消光系數26900 L/(mol·cm);A為吸光度。

1.2.5.2 花色苷保留率的計算

式中：A1:包埋前測定花色苷含量時溶液吸光度；A2:包埋后測定花色苷含量時溶液吸光度。

1.2.5.3 微膠囊包埋率的計算

式中:M1為微膠囊總花色苷的含量,mg;M2為微膠囊表面花色苷的含量,mg。

1.2.5.4 微膠囊總花色苷含量的測定 稱取0.2 g玫瑰茄花色苷微膠囊,加少量pH3的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液[16],充分研磨。將破碎后的微膠囊放在漏斗中,用緩沖液沖洗過濾至10 mL容量瓶中,定容,計算花色苷含量[17]。

1.2.5.5 微膠囊表面花色苷含量的測定 稱取0.2 g玫瑰茄花色苷微膠囊,放入漏斗中用75%乙醇溶液沖洗微膠囊,過濾至10 mL容量瓶中,定容,計算花色苷含量[17]。

1.2.6 顆粒形態觀察 將制備的玫瑰茄花色苷微膠囊平鋪在干燥的比色皿上,用眼睛觀察其顆粒形態,并用游標卡尺測定微膠囊的直徑。

1.2.7 紅外光譜掃描分析 采用紅外光譜儀結合KBr壓片法分別對花色苷、微膠囊壁材及微膠囊化花色苷,在波長為400～4000 cm-1范圍內進行紅外光譜掃描分析,分析樣品的紅外光譜圖。

1.2.8 玫瑰茄花色苷微膠囊貯藏穩定性

1.2.8.1 溫度對花色苷微膠囊穩定性的影響 取適量微膠囊化前后玫瑰茄花色苷,在避光條件下,分別置于具塞錐形瓶中,每隔7 d稱取一定量微膠囊溶于pH3的緩沖溶液中,測定不同溫度(4、25、50 ℃)下花色苷及花色苷微膠囊樣品的保留率,監測35 d。

1.2.8.2 光照對花色苷微膠囊穩定性的影響 取適量微膠囊化前后玫瑰茄花色苷,室溫分別置于具塞錐形瓶中,每隔7 d稱取一定量微膠囊溶于pH3的緩沖溶液中,測定不同光照(避光、自然光)條件下花色苷及花色苷微膠囊樣品的保留率,監測35 d。

1.2.9 玫瑰茄花色苷微膠囊體外緩釋效果評價 人工胃、腸液的制備參照謝巖黎等[18]配制方法。

人工胃、腸液條件下的緩釋效果評價:分別稱取0.2 g花色苷微膠囊,加入盛有50 mL人工胃、腸液的錐形瓶中,在37 ℃、50 r/min條件下恒溫振蕩,每隔30 min測定釋放率。花色苷微膠囊釋放率按以下公式計算:

1.3 數據處理

以上各項實驗重復3次。用Design-Expert V8.0.6軟件進行數據分析,應用Origin 9.0作圖。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 殼聚糖質量分數比對微膠囊包埋率的影響 不同殼聚糖質量分數對微膠囊包埋率的影響,如圖2所示。

圖2 殼聚糖質量分數對包埋率的影響Fig.2 Effects of chitosan concentration on the entrapment efficiency of anthocyanins

由圖2可見,隨著殼聚糖質量分數的不斷增大,在0.05%～0.25% 范圍內,玫瑰茄花色苷包埋率先增加隨后下降,當殼聚糖質量分數為0.1%時,包埋率最高,為97.1%，與0.05%相比增加明顯。這是由于殼聚糖質量分數低于0.1%時,殼聚糖與海藻酸鈉發生絡合反應機會降低,破壞微膠囊成型效果。當殼聚糖質量分數超過0.1%時,壁材量過高,壁材之間碰撞的機會增加,而壁材芯材之間碰撞的機會減少,使包埋率降低[19]。因此,本研究選取殼聚糖質量分數為0.1%～0.2%進行后續研究。

2.1.2 CaCl2質量分數對微膠囊包埋率的影響 不同CaCl2質量分數對微膠囊包埋率的影響,如圖3所示。

圖3 CaCl2質量分數對包埋效率的影響Fig.3 Effects of CaCl2 concentration on the entrapment efficiency of anthocyanins

由圖3可見,CaCl2質量分數在1.0%～2.0%時,微膠囊包埋率增加,大于2.0%隨著CaCl2質量分數的增加逐漸減小。這是由于CaCl2在整個包埋過程中發揮交聯和固化的作用,CaCl2質量分數較小時,固化作用小,微膠囊呈片狀而且包埋率低。當CaCl2質量分數較大時,CaCl2與海藻酸鈉快速形成致密的交聯結構,包埋過程中芯材的損失量少,但機械強度較大,降低緩釋性能[20]。因此,本研究選取CaCl2質量分數范圍為1.5%～2.0%。

2.1.3 海藻酸鈉質量分數對微膠囊包埋率的影響 不同海藻酸鈉質量分數對微膠囊包埋率的影響,如圖4所示。

圖4 海藻酸鈉質量分數對包埋率的影響Fig.4 Effects of sodium alginate concentration on the entrapment efficiency of anthocyanins

由圖4可見,海藻酸鈉質量分數為2.2%時,玫瑰茄花色苷包埋率最高,為96.8%,之后隨海藻酸鈉質量分數增加,包埋率降低。這是由于海藻酸鈉添加量過大時,配制成的溶液較粘稠,制囊時不易滴落,微膠囊呈橢圓形。當海藻酸鈉質量分數為2.4%，包埋率只有86.7%。因此,本研究選取海藻酸鈉質量分數為1.8%～2.2%。

2.1.4 壁芯比對微膠囊包埋率的影響 不同壁芯比對微膠囊包埋率的影響,如圖5所示。

圖5 壁芯比對包埋率的影響Fig.5 Effect of wall/core material ratio on the entrapment efficiency of anthocyanins

由圖5可見,隨著壁芯比逐漸遞增,在1∶1～2∶1的范圍內,玫瑰茄花色苷包埋率不斷增大,2∶1～3∶1的范圍內逐漸下降,當壁芯比為2∶1時,包埋率最高,為95.2%。這是由于壁材比例過少時,壁材不能完全包裹住花色苷,花色苷分散在微膠囊的表面,使花色苷容易損失[13],包埋率降低。當壁材比例過高時,由于滴注針管孔徑不變,微膠囊包埋的有效成分會相對減少,微膠囊的品質會隨之降低。因此,本研究選取壁芯比范圍為1.1∶1～2.5∶1。

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 響應面試驗方案及結果 根據2.1的實驗結果,考察海藻酸鈉質量分數(A)、CaCl2質量分數(B)、壁芯比(C)、殼聚糖質量分數(D)這4個主要影響因素。實驗方案及結果見表2。

表2 響應面試驗結果Table 2 Results of response surface test

2.2.2 模型方程的建立與顯著性試驗 采用Design-Expert V8.0.6軟件對響應面試驗數據進行分析,得到玫瑰茄花色苷微膠囊包埋率與各因變量的模擬方程為:Y=+97.70+0.42A+0.74B-0.53C+0.29D-0.42AB-0.18AC+0.66AD+0.34BC-0.45BD+0.96CD-0.71A2-0.44B2-0.59C2-0.79D2。回歸方程拋物面開口向下,具有極大值點,可以對玫瑰茄花色苷微膠囊工藝條件進行優化[21-22]。方差分析結果見表3。

表3 回歸模型方差分析表Table 3 Analysis of variance of the regression model

由表3可知,所得的回歸方程模型項極顯著(p<0.0001),且失擬檢驗不顯著(p=0.1245>0.05),說明此回歸模型理想,用方程擬合4個因素與包埋率之間的關系是可行的。決定系數R2=0.9223,說明包埋率的實測值與預測值之間有較好的擬合度。綜合以上分析可知:該模型與實際情況擬合較好,可用于預測包埋率的變化情況。從對包埋率的影響來看,一次項B(CaCl2質量分數)對包埋率影響極顯著(p<0.01),其余因素均有顯著影響(p<0.05),根據F值可知,4個考察因素對包埋率的影響順序為B>C>A>D;二次項對包埋結果均有顯著影響(p<0.05),交互項BC、BD、CD對包埋結果有顯著影響(p<0.05)。

2.2.3 響應面優化分析 等高線圖可以直觀地反映兩變量交互作用的影響程度,圓形表示兩因素交互作用不顯著,而橢圓形與之相反[23]。根據回歸方程繪制響應面圖見圖6。

為考察各個因素交互對玫瑰茄花色苷微膠囊包埋率的影響,將兩個影響因素固定在零水平,分析另外兩個因素的交互作用對玫瑰茄花色苷微膠囊包埋率影響。由圖6a～圖6c可以看出,兩兩因素交互作用不顯著,表現為等高線呈圓形且曲線稀疏,響應面的坡度走勢平緩。由圖6d可以看出,包埋率隨著CaCl2質量分數和壁芯比的增加都是先增加后趨于平穩。CaCl2質量分數和壁芯比之間的交互作用對包埋率的影響較為顯著(p<0.05),表現為等高線呈橢圓形且曲線較密集。同理,由圖6e、6f可以看出,CaCl2質量分數和殼聚糖質量分數、壁芯比和殼聚糖質量分數之間存在較顯著的交互作用,表現為等高線呈橢圓形且曲線較密集。

圖6 各因素交互作用對微膠囊包埋率影響的等高線和響應面圖Fig.6 Contour and response surface plots showing the interactions of various factors on microencapsulation efficiency

2.2.4 驗證試驗結果 利用Design-Expert 8.0.6軟件得到了玫瑰茄花色苷最佳包埋工藝為海藻酸鈉質量分數1.98%,CaCl2質量分數2.46%,壁芯比1.73∶1 g/g,殼聚糖質量分數0.13%,優化得到理論值為98.08%。為了可行性操作,調整參數為海藻酸鈉質量分數2.0%,CaCl2質量分數2.0%,壁芯比2∶1 g/g,殼聚糖質量分數0.1%,此條件下進行3次平行實驗,得到玫瑰茄花色苷實際包埋率為99.2%,標準差為0.16%,與預測值擬合性好,可進行后續的研究。

2.3 銳孔法制備微膠囊花色苷的形態觀察

圖7為最優條件下,利用銳孔法制備的微膠囊花色苷,平均顆粒直徑為7 mm,形狀呈球形,表面光滑,半數以上無拖尾現象,符合實際制備和使用要求。

圖7 玫瑰茄花色苷微膠囊顆粒形態Fig.7 Morphology of anthocyanins microspheres from Hibiscus sabdariffa

2.4 花色苷微膠囊紅外光譜測定結果

紅外光譜主要是利用紅外光對物質進行分析和鑒定的一種光譜學方法,它根據紅外光譜特征峰的形狀、強度及位置,可以判斷微膠囊是否形成[24]。花色苷、微膠囊化三種壁材及微膠囊的紅外光譜見圖8。由圖8可以看出,海藻酸鈉在3435 cm-1處的特征吸收峰,是由O-H的伸縮振動引起的;在1598 cm-1處是C=O的特征吸收峰,由于羰基形成氫鍵使吸收峰發生藍移引起的;在1416 cm-1處特征峰,由于羧酸鹽引起的對稱伸縮振動;在1030 cm-1處有一個寬的吸收峰,是由于C-O引起的伸縮振動。殼聚糖在3418 cm-1處有一個較寬的吸收峰,是由于N-H中不對稱和對稱伸縮振動引起的;在1633和1422 cm-1處特征峰的主要振動方式為-NH3+的對稱和不對稱的彎曲振動;在1159 cm-1處特征峰,是由于C-O引起的伸縮振動。花色苷樣品的主要特征峰在3424、1619、1428;3424 cm-1處的特征峰是由于樣品在冷凍干燥過程中殘留的水分導致了O-H的伸縮振動;在1619和1410 cm-1處特征峰,是由于芳環骨架C=C鍵引起的伸縮振動。花色苷在1741～1069 cm-1處出現了特征吸收峰,而微膠囊的圖譜中未出現,這是由于玫瑰茄花色苷的吸收峰大多被海藻酸鈉和殼聚糖壁材所掩蓋,由此可證明玫瑰茄花色苷的微膠囊已經形成。

圖8 不同的壁材、花色苷和微膠囊的紅外光譜圖Fig.8 FTIR spectra of encapsulated anthocyanins powder, anthocyanins extractsand different wall materials

2.5 玫瑰茄花色苷微膠囊貯藏穩定性分析

2.5.1 溫度對花色苷微膠囊穩定性的影響 由圖9可見,花色苷和花色苷微膠囊在4 ℃條件下貯藏35 d,保留率較高,穩定性好;但在25和50 ℃條件下,花色苷微膠囊的保存率明顯高于同溫度下花色苷的保存率。這表明,低溫下花色苷的存在形式不會影響花色苷的保存率;在常溫或高溫環境下,需要將花色苷制成微膠囊形式以提高花色苷的保存率,由此說明微膠囊化對花色苷具有一定的保護作用,提高其穩定性,易于貯藏。與Yamdech等[25]高溫下有利于桑葚花色苷微膠囊的保存的研究結果一致。

圖9 溫度對花色苷微膠囊穩定性的影響Fig.9 Effect of temperature on the stability of anthocyanins microcapsules

2.5.2 光照對花色苷微膠囊穩定性的影響 由圖10可見,隨著貯藏時間的延長,在光照條件下,微膠囊化花色苷的保留率明顯高于未微膠囊化花色苷,說明微膠囊化能有效提高花色苷穩定性。在避光條件下,兩種狀態的花色苷均有較高的保留率,說明避光有利于花色苷的貯藏。與微膠囊化玉米黃色素具有光保護作用,明顯提高玉米黃色素的保存率的研究結果[26]一致。

圖10 光照對花色苷微膠囊穩定性的影響Fig.10 Effects of light on the stability of anthocyanins microcapsules

2.6 花色苷體外緩釋效果評價

玫瑰茄花色苷微膠囊在體外模擬人工胃、腸液的緩釋效果,如圖11所示。

圖11 花色苷微膠囊的釋放率Fig.11 Release rate of anthocyanins microspheres

由圖11可見,玫瑰茄花色苷微膠囊在人工胃、腸液中的釋放率隨著時間的延長而增加;從折線趨勢可看出,微膠囊在人工腸液比在人工胃液中的釋放速率快。當30 min時,在胃液和腸液中釋放率相差無幾,均為8%左右,但隨著時間的推移,腸液中的釋放率增加迅速,在120 min時腸液中的釋放率已達61%,超過總量的一半,但此時胃液中的釋放率僅為17.4%,遠遠小于腸液中的釋放量。這是因為殼聚糖分子中的氨基與海藻酸鈉分子中的羥基的成膜作用受pH影響較大,在堿性條件下,殼聚糖分子中的氨基質子化程度降低,導致壁材變薄,機械強度降低,易發生溶脹,隨著時間的延長,使芯材完全釋放出來[16]。在210 min時,微膠囊中花色苷在腸液中能被完全釋放。由花色苷的生物活性研究可知,花色苷可通過腸道細胞吸收進入血漿和組織,達到有效利用。這表明微膠囊花色苷能有效提高花色苷的利用率。

3 結論

本研究以殼聚糖、海藻酸鈉為壁材,采用銳孔法制備玫瑰茄花色苷微膠囊,并利用響應面法優化得到玫瑰茄花色苷微膠囊制備的最佳工藝參數為海藻酸鈉質量分數2.0%,CaCl2質量分數2.0%,壁芯比2∶1 g/g,殼聚糖質量分數0.1%,玫瑰茄花色苷包埋率為99.2%。玫瑰茄花色苷微膠囊平均顆粒直徑為7 mm。由紅外光譜分析可知,與花色苷比較,微膠囊花色苷在1741～1069 cm-1特征吸收峰發生變化,說明玫瑰茄花色苷微膠囊形成。在低溫或常溫條件下微膠囊化玫瑰茄花色苷具有較好的穩定性。在模擬體外人工胃、腸液緩釋效果時,花色苷微膠囊在人體胃、腸液中都具有一定的緩釋效果,能更好的保證花色苷在人體的吸收利用。