靜樂黑枸杞多糖的提取及抗氧化性分析

曹葉霞,王澤慧,賀金鳳,左 鑫

(忻州師范學院化學系,山西忻州 034000)

黑枸杞是我國傳統食藥兩用名貴中藥材,與普通枸杞相比,黑枸杞的營養價值更高。黑枸杞中多糖是發揮其功能的主要物質,具有良好的保濕性,能有效防止視力降低,在保健方面對人體大有益裨,可減緩人體血管硬化,對預防心臟疾病、增強大腦記憶力等方面都有顯著功效,經過研究發現黑枸杞多糖在抗氧化性、免疫等生物活性方面有重大作用[1]。

目前黑枸杞多糖的研究還較局限,主要集中在新疆和甘肅產地的黑枸杞。Liu等[2]將青海黑枸杞用Box-Behnken設計和響應面結合,優化出用微波輔助提取多糖的最佳條件,而且具有良好的抗氧化活性。Peng等[3]對青海黑枸杞多糖結構進行了研究,得到了5種結構的多糖分子。魯小靜等[4]對新疆黑枸杞采用傳統水提醇沉法進行了提取工藝研究,結果表明熱水溫度90 ℃,時間66 min,料液比1∶25 (g/mL)條件下黑果枸杞多糖得率為29.36%。白紅進等[5]主要研究了四種提取方法對新疆黑枸杞多糖得率的影響,結果表明超聲-微波協調萃取提取多糖的效果最佳。但未見對靜樂縣2012年引進試種的黑枸杞進行系統的研究,本文以此為研究對象，采用超聲波法探索黑枸杞多糖的最佳提取條件,同時測定提取物對DPPH·、·OH、ABTS+·的清除能力和總還原能力。以期為深加工產品提供理論依據,進一步增加其經濟價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑枸杞 產自山西省忻州市靜樂縣;ABTS 阿拉丁上海晶純生化科技股份公司;DPPH 西格瑪奧德里奇貿易公司;透明質酸 化妝品級,山東福瑞達生物醫藥公司;其他試劑 均為國產分析純;實驗用水 均為二次蒸餾水。

KQ-400KDE型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器公司;V-5100型可見分光光度計 上海元析儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 靜樂黑枸杞的預處理 將黑枸杞在避光條件下陰干,將其粉碎,過60目篩,然后進行回流脫脂處理:粗稱200.0 g黑枸杞于1000 mL圓底燒瓶中,加入500 mL石油醚，控制溫度60 ℃水浴回流2 h,抽濾[6],濾渣用少許石油醚洗滌3～4次,揮盡石油醚并于55 ℃烘箱中干燥,制得靜樂黑枸杞樣品,裝瓶待用。

1.2.2 葡萄糖標準曲線的繪制 準確稱量0.0750 g葡萄糖,配成0.15 mg·mL-1葡萄糖儲備溶液,分別取7個25 mL比色管,依次加入0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mL儲備液,補加蒸餾水至5.00 mL,用苯酚-硫酸法[7]在484 nm處測其吸光度,記錄數據,得到標準曲線。A=38.457C+0.0132,其中R=0.9999。

1.2.3 黑枸杞多糖的提取及測定 準確稱取0.5000 g靜樂黑枸杞樣品置于100 mL錐形瓶中,按實驗要求加入定量蒸餾水,在一定條件下進行超聲提取,提取結束后在轉速為4000 r·min-1下離心10 min,將離心后的提取液同洗滌液一起轉移至25 mL容量瓶中定容。從此容量瓶中取1.00 mL多糖提取液于另一個25 mL容量瓶中,加蒸餾水定容至刻度線。取0.50 mL稀釋液顯色后測定其吸光度,根據下式計算多糖的得率Y:

式中C:顯色后溶液的濃度,由標準工作曲線得到,mg·mL-1,D:稀釋倍數,V:溶液體積mL,M:樣品質量，g。

1.2.4 單因素實驗 用1.2.3下方法提取黑枸杞多糖,提取條件為:固定超聲條件為溫度60 ℃，時間1 h，功率320 W,考察液料比(mL/g)分別為20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1對多糖得率的影響;固定超聲條件為溫度60 ℃，液料比(mL/g)40∶1，功率320 W,考察超聲時間分別為30、40、50、60、70、80、90 min對多糖得率的影響;固定超聲條件為溫度60 ℃，液料比40∶1，時間50 min,考察超聲功率為160、200、240、280、320、360、400 W對多糖得率的影響;固定超聲條件為功率320 W，液料比(mL/g)40∶1，時間50 min,考察超聲溫度40、50、60、70、80 ℃對多糖得率的影響。

1.2.5 響應面試驗 應用響應面軟件設計實驗,見表1。

純氮施用量為102 kg/hm2。基肥可施用復合肥（10∶8∶24）594 kg/hm2，采用定點定位環行施肥法在理墑前施下。提苗肥在煙株移栽后7 d內施加，30%的追肥在栽后20～25 d施加。

表1 響應面分析法的因素與水平Table 1 Factors and levels used in response surface methodology

1.2.6 黑枸杞提取物抗氧化性實驗 取適量的黑枸杞樣品在最佳條件下用水提取,提取液在85%～90%的乙醇中醇沉24 h。在4000 r·min-1轉速下離心5 min得提取物固體,將固體放入冷凍干燥機中干燥,得到靜樂黑枸杞提取物裝瓶待用。

1.2.6.1 靜樂黑枸杞提取物對ABTS+·清除率測定 將5.00 mL的7.40 mol·L-1ABTS儲備液與88 μL 2.60 mol·L-1K2S2O8混勻,在冰箱靜置12～16 h,制得ABTS+·工作液(此工作液要現配現用,而且要求低溫避光保存)。準確移取0.40 mL ABTS+·,用 PBS(pH=7.40)溶液稀釋,在常溫下730 nm處吸光值為0.719。精確吸取2.00 mL ABTS+·和1.00 mL 0.06、0.08、0.12、0.20、0.25、0.33、0.40、0.50、0.67、0.83、1.00 mg·mL-1樣品混合搖勻,在常溫避光靜置6 min,在波長為730 nm下測吸光度Ai,以蒸餾水代替樣液測定吸光度A0,平行測定3次[8],同時以抗壞血酸做對照。ABTS+·清除能力S見下式。

IC50表示在該濃度下樣品的清除率為50%,在實驗中常用它的值來表示樣品抗氧化活性的高低。

1.2.6.2 靜樂黑枸杞提取物對DPPH·清除率測定 配制DPPH·儲備液,濃度為1×10-4mol·L-1,取20.00 mL定容于100 mL容量瓶中,配制成 2×10-5mol·L-1工作液。加入0.03、0.04、0.06、0.07、0.10、0.20、0.22、0.50、1.00 mg·mL-1提取物溶液1.00 mL和2.00 mL DPPH·溶液,混勻,靜置20 min,在波長為517 nm下測定吸光度AD。分別以等量二次蒸餾水代替不同濃度提取物加入反應體系,測定吸光度為A水,以無水乙醇代替DPPH·,測定吸光度為A糖,吸光度取平行測定三次后的均值[9],同時以抗壞血酸做對照。計算DPPH·清除率見下式。

1.2.6.3 靜樂黑枸杞提取物對·OH清除率測定 將2.00 mL pH=7.40的磷酸鹽緩沖液加入25 mL比色管中,然后加入1.00 mL 2.50×10-3mol·L-1鄰二氮菲溶液和0.15 mL 6.25×10-4mol·L-1硫酸亞鐵溶液,最后用水定容到10 mL為A0溶液,2.00 mL緩沖溶液用水定容到10 mL作為A0參比溶液。在25 mL比色管中加入精確吸取的2.00 mL緩沖液,然后再加入1.00 mL鄰二氮菲溶液和0.15 mL硫酸亞鐵溶液,2.00 mL水,振蕩搖勻后加入1.00 mL 5.00×10-3mol·L-1過氧化氫后再次搖勻,用水定容到10 mL為A1溶液,參比溶液為2.00 mL緩沖溶液和1.00 mL過氧化氫定容到10 mL。將A1中的2.00 mL水換為2.00 mL不同質量濃度的提取物溶液為Ai,將A1參比溶液中的1.00 mL過氧化氫換為2.00 mL不同質量濃度的提取物溶液為Ai的參比溶液。將上述的比色管放置于37 ℃水浴保溫90 min,在510 nm處測其吸光度[10-12]。按下式計算清除率,同時以抗壞血酸做對照,平行測定3次。

1.2.6.4 靜樂黑枸杞提取物總還原能力的測定 在比色管中加入2.50 mL 0.10、0.50、0.80、0.10、1.00、2.00、3.00、4.00、6.00 mg·mL-1的樣品溶液,2.50 mL pH=6.64磷酸鹽緩沖液,2.50 mL 0.1%鐵氰化鉀溶液,于50 ℃水浴反應20 min,將比色管取出加入2.50 mL 10%三氯乙酸溶液終止反應,加入1.00 mL 0.1%三氯化鐵溶液,在50 ℃水浴鍋中反應10 min。在700 nm處測其吸光度[13],同時以抗壞血酸做對照,平行測定3次。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.2 單因素實驗分析

2.2.1 液料比對靜樂黑枸杞多糖得率的影響 如圖2所示,靜樂黑枸杞多糖的得率隨液料比的增加先上升后下降。液料比太小時多糖無法充分溶解,液料比增大得率增大,液料比大于40∶1 mL/g時,由于液料比太小時，單位體積受到的超聲作用變小，從而影響多糖的溶出，使得得率降低[18]。因此靜樂黑枸杞中多糖提取最佳液料比為40∶1 mL/g。

圖2 液料比對多糖得率的影響Fig.2 Effects of ratio of material to liquid on extraction yield

圖3 超聲時間對多糖得率的影響Fig.3 Effects of extraction time on extraction yield

2.2.3 超聲功率對靜樂黑枸杞中多糖得率的影響 如圖4所示,靜樂黑枸杞中多糖的得率隨超聲功率的增加先上升后下降。超聲波產生聲波空化作用會破壞黑枸杞的細胞壁,加速細胞中的多糖的溶出,空化作用越大,得率越高,而過大的空化作用會破壞多糖分子結構[19],使得得率降低。在功率為360 W時達到最大,因此,靜樂黑枸杞中多糖提取最佳超聲功率為360 W。

圖4 超聲功率對多糖得率的影響Fig.4 Effects of ultrasonic power on extraction yield

2.2.4 超聲溫度對靜樂黑枸杞中多糖得率的影響 如圖5所示,靜樂黑枸杞中多糖的得率隨溫度的升高先上升后下降。一般來說,溫度的升高會通過增加溶劑分子和溶質分子的運動,促進擴散,從而有利于提高多糖得率,但溫度過高破壞多糖結構[20]。因此,靜樂黑枸杞中多糖提取最佳超聲溫度為70 ℃。

圖5 超聲溫度對多糖得率的影響Fig.5 Effects of ultrasonic temperatures on extraction yield

2.3 響應面優化試驗結果

2.3.1 靜樂黑枸杞多糖的得率回歸模型的建立及顯著性實驗 按照Box-Behnken試驗方案結果見表2。將得率利用Design Expert軟件進行擬合,得到以多糖得率(Y)為目標函數的二次回歸方程:

表2 靜樂黑枸杞多糖得率Box-Behnken試驗結果Table 2 Arrangement and experimental results of the BBD

Y(%)=13.90+0.29A+0.15B-0.037C+0.033D-0.46AB-0.22AC-0.083AD+0.30BC-0.32BD-0.58CD-0.84A2-0.81B2-0.52C2-0.96D2

為了檢驗回歸方程是否可以使用,對黑枸杞多糖提取的回歸模型進行方差分析,從表3中可以看出,模型p<0.01為極顯著,失擬誤差為0.1287>0.05,不顯著,所以此回歸模型與實驗結果擬合程度比較好。四個單因素之間的影響作用為液料比>超聲時間>超聲功率>超聲溫度。AB、BD、CD的p<0.01,為極顯著水平,BC的p=0.0133<0.05為顯著水平。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equation

2.3.2 靜樂黑枸杞多糖的等高線圖和響應面圖分析、優化 等高線圖越接近橢圓,3D圖中坡度越陡峭,說明兩因素之間的交互作用越顯著,即對得率的影響越大。從圖6可以得知,液料比和超聲時間、超聲功率和超聲溫度、超聲時間和超聲溫度的3D圖很陡峭,而且等高線圖接近橢圓形,因此液料比和超聲時間、超聲功率和超聲溫度、超聲時間和超聲溫度之間的交互作用極顯著(p<0.01),而超聲時間和超聲功率的3D圖較陡峭,同時等高線圖近似橢圓,所以超聲時間和超聲功率之間的交互作用顯著(p<0.05)。

圖6 各因素交互作用對多糖得率影響的3D圖和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plot of variable parameters on the yield of polysaccharides

2.3.3 靜樂黑枸杞多糖最佳提取條件的確定和驗證實驗 利用Design Expert軟件分析,多糖的最佳提取條件液料比、超聲時間、超聲功率、超聲溫度依次為41.72∶1 (mL/g)、50.25 min、356.77 W、70.29 ℃,得率的預測值為13.92%。由于考慮到實際操作情況最后確定最佳工藝條件為40∶1 (mL/g)、50 min、360 W、70 ℃。在此條件下進行三次平行實驗,靜樂黑枸杞多糖平均得率為13.89%,與預測值的相對誤差為0.22%,說明此方程與實際情況擬合較好。

2.4 靜樂黑枸杞提取物抗氧化性試驗結果

2.4.1 靜樂黑枸杞提取物清除ABTS+·的能力 如圖7所示,隨著提取物濃度的增加,ABTS+·清除率增加,提取物的清除率最大可以達到96.46%,其IC50=0.40 mg·mL-1,但是在相同的濃度下,抗壞血酸對ABTS+·的清除能力較大。

圖7 靜樂黑枸杞提取物清除ABTS+·的能力Fig.7 Scavenging effects of the extracts of Lycium ruthenicum of Jingle on ABTS+·free radicals

2.4.2 靜樂黑枸杞提取物清除DPPH·的能力 如圖8所示,隨著抗壞血酸和提取物濃度的增加,DPPH·清除率均增加,靜樂黑枸杞提取物的濃度達到0.3 mg·mL-1時清除率為88.07%,并逐漸趨于平緩,其IC50=0.125 mg·mL-1,比寧夏黑枸杞IC50=1.22 mg·mL-1小[21],但是在相同的濃度下,抗壞血酸對DPPH·清除能力較大。

圖8 靜樂黑枸杞提取物清除DPPH·的能力Fig.8 Scavenging effects of the extracts of Lycium ruthenicum of Jingle on DPPH· free radicals

2.4.3 靜樂黑枸杞提取物清除·OH的能力 由圖9可知,靜樂黑枸杞提取物清除·OH的能力隨著濃度的加大而升高,其最大清除率可以達到77.91%,其IC50=6.00 mg·mL-1,比柴達木盆地黑枸杞的IC50=1.84 mg·mL-1大[2],同時遠低于相等濃度的抗壞血酸對·OH的清除率,因此靜樂黑枸杞提取物對·OH的清除效果不如抗壞血酸。

圖9 靜樂黑枸杞提取物清除·OH的能力Fig.9 Scavenging effects of the extracts of Lycium ruthenicum of Jingle on hydroxyl free radicals

2.4.4 靜樂黑枸杞提取物總還原能力 一種化合物的還原能力可以作為潛在的抗氧化活性的一個重要指標。一般情況下,樣品的還原能力與抗氧化性呈顯著的相關性;樣品反應后的生成物在700 nm處有最大吸收,吸光值的大小反映了抗氧化能力的大小,吸光度值越大,則樣品的還原能力越。如圖10所示,隨著濃度增大靜樂黑枸杞提取物和抗壞血酸的還原能力在增大。當靜樂黑枸杞提取物的濃度達到3.00 mg·mL-1時還原能力達到最大,并逐漸趨于平緩,而抗壞血酸濃度達到0.08 mg·mL-1時,還原能力達到最大并逐漸趨于平緩,表明黑枸杞提取物還原能力較小。

圖10 靜樂黑枸杞提取物的還原能力Fig.10 Reducing capacity of the extracts of Lycium ruthenicum of Jingle

3 結論

靜樂黑枸杞多糖最佳提取工藝條件:液料比、超聲時間、超聲功率、超聲溫度依次為40∶1 (mL/g)、50 min、360 W、70 ℃,多糖的得率為13.89%,與理論預測值的相對誤差為0.22%,說明優化工藝可靠。靜樂黑枸杞提取物對DPPH·、·OH以及ABTS+·清除能力,隨著提取物濃度的升高而增加,其中IC50分別為0.125、6.00、0.40 mg·mL-1,因此,靜樂黑枸杞提取物具有較好的抗氧化活性。