基于拉曼光譜快速檢測山西老陳醋醋泥中總黃酮方法的建立

李葉麗,溫丹華,李 鑫,黃登宇

(1.山西大學生命科學學院,山西太原 030006;2.山西大學食品藥品快檢技術中心,山西太原 030006;3.山西省食品藥品監督管理局,山西太原 030031)

老陳醋,作為山西省地標產品之一,歷史悠久,其色澤深褐、醋香濃郁、酯香醇厚、過夏不腐、入冬不凍。研究表明食醋具有抗疲勞、調節血糖、血脂、降血壓、抗氧化等多種生理功能[1]，品牌價值不言而喻,然而摻假、勾兌現象時有發生,因此,對其進行品牌保護,加強一線快速檢測,提高檢測的速度與準確率具有極其重要的意義[2-3]。

總黃酮作為山西老陳醋新增重要質量評價和特征指標之一,可以用來鑒假、識偽[4]。目前,對于總黃酮檢測,多采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH體系比色法[5-8],但是該方法滴定試劑多,需要熟練的操作人員,不利于基層人員一線使用。因此建立快速檢測技術尤為必要。拉曼光譜快速檢測技術作為一種快速檢測技術,是光照射在被測分子上發生非彈性散射,與被測分子之間發生能量交換,光子除運動方向發生變化之外,其頻率也發生變化,這種頻率的變化只與分子的振動與轉動頻率有關。正是利用這種特性,實現對物質的定性定量檢測[9-10]。該技術具有樣品無需前處理、操作簡便、時間短、靈敏度高等優點,可以實現樣品快速、無損傷、定性定量檢測分析,最大的優點是水的拉曼散射很微弱,所以拉曼光譜檢測技術是研究含水體系的理想工具[11],現已廣泛應用于食品分析檢測中[12-14]。

本試驗嘗試使用便攜式拉曼檢測儀對山西老陳醋醋泥中總黃酮進行定量檢測,以黃酮類物質在其拉曼特征峰處強度為指標,優化積分時間、激光功率、積分次數,以期建立老陳醋中總黃酮的拉曼光譜數據庫,同時拓展拉曼光譜儀的適用范圍,為實現山西老陳醋一線質量安全監管提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山西老陳醋醋泥 山西寧化府醋廠提供;蘆丁(HPLC≥98%) 北京索萊寶科技有限公司;NaNO2天津市德恩化學試劑有限公司;Al(NO3)3天津市耀華化學試劑有限責任公司;NaOH 天津市大陸化學試劑廠;CH3CH2OH 天津市風船化學試劑廠;硼砂(純度≥99.5%) 天津市天大化工實驗廠;Ca(OH)2(純度≥95.0%) 中國醫藥公司北京采購供應站;ACN(前處理試劑)、納米增強檢測試劑(OTR103、OTR202) 蘇州歐普圖斯光學納米科技有限公司;化學試劑 均為國產分析純。

BSA224S電子天平(d=0.01 g) 德國Sartorius公司;SC-3610低速離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司;UPT-I-10T超純水器 四川優普超純科技有限公司;PB-10 pH計 德國Sartorius公司;KQ-300DE超聲波儀 昆山市超聲儀器有限公司;UV-1600紫外/可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司;RamTracer-200-QCM便攜式拉曼光譜儀 蘇州歐普圖斯光學納米科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 粗提取及純化醋泥中總黃酮 準確稱取山西老陳醋醋泥2.0 g,3000 r/min離心10 min,棄上清液,取沉淀。加入60%乙醇30 mL,保鮮膜封口,50 ℃、60 W超聲50 min,3000 r/min離心20 min,棄沉淀,上清液即老陳醋醋泥中總黃酮粗提液[15-17]。

加入3倍體積飽和Ca(OH)2溶液及少量3%硼砂溶液調整提取液pH至8～9,將其處理液離心并取其上清液,實現對總黃酮粗提液的純化[18-19]。

1.2.2 總黃酮拉曼光譜快速檢測方法的建立 常溫下取1.2.1純化后溶液20 μL,依次加入500 μL OTR202,100 μL OTR103,振蕩混勻,在積分時間20 s,積分次數10,激光功率300 mW條件下上機檢測,用air-PLS方法去熒光背景處理[20],Origin 7.5進一步平滑處理,平滑系數為20。

1.2.3 選取總黃酮拉曼特征峰 配制蘆丁儲備液(2.0 mg/mL),將蘆丁儲備液、樣品溶液及蘆丁與樣品混合溶液(體積比為1∶1),按1.2.2步驟進行檢測。

1.2.4 建立拉曼光譜快速檢測法標準曲線 將蘆丁儲備液分別稀釋到0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL,按1.2.2步驟進行操作,以特征峰位置峰強度為縱坐標,蘆丁質量濃度為橫坐標,繪制標準曲線,得出線性方程。

1.2.5 拉曼快速檢測條件優化 通過單因素試驗確定最佳積分時間、激光功率和積分次數。

1.2.5.1 優化積分時間 取20 μL樣品溶液6份,固定積分次數10次,激光功率300 mW,分別設置積分時間為5、10、15、20、25、30 s,重復三次?？疾觳煌e分時間下總黃酮拉曼特征峰強度。

1.2.5.2 優化激光功率 取20 μL樣品溶液7份,積分時間用1.2.5.1中選定條件,固定積分次數10次,分別設置激光功率為50、100、150、200、250、300、350 mW,重復三次?？疾觳煌す夤β氏驴傸S酮拉曼特征峰強度。

1.2.5.3 優化積分次數 取20 μL樣品溶液5份,積分時間用1.2.5.1中選定條件,激光功率用1.2.5.2中選定條件,分別設置積分次數為5、10、15、20次,重復三次。考察不同積分次數下總黃酮拉曼特征峰強度。

1.2.6 拉曼光譜快速檢測方法學評價 對拉曼光譜快速檢測方法精密度、重現性、穩定性及加標回收率進行測定。取總黃酮提取液1份,連續測定5次,評價方法精密度;取總黃酮提取液5份,分別測定,評價方法重現性。取總黃酮提取液1份,測定5次,每次間隔30 min,評價方法穩定性。取已知濃度的總黃酮提取液5份,分別加0.025、0.05、0.1、0.2、0.3 mg/mL的蘆丁標品,進行檢測,評價方法加標回收率。所有試驗均在優化拉曼條件下,按1.2.2步驟進行操作。所有試驗均重復三次,取平均值,依據特征峰處拉曼強度測定結果計算RSD值進行方法評價。

1.2.7 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH體系比色法測定總黃酮

1.2.7.1 測定方法 吸取總黃酮提取液2.00 mL(兩份),分別加入1.00 mL NaNO2溶液(50 g/L),混勻,靜置6 min;分為試驗組和對照組,實驗組中加入1.00 mL Al(NO3)3溶液(100 g/L)并振蕩混勻,對照組中不添加,靜置6 min;分別加入4.00 mL NaOH 溶液(200 g/L),振蕩混勻,靜置15 min。以對照組調節零點,在波長510 nm 處,測定試驗組吸光度[4]。

1.2.7.2 建立NaNO2-Al(NO3)3-NaOH體系比色法標準曲線 準確吸取0.00、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00 mL蘆丁標準使用液(相當于0.00、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80 mg無水蘆丁),補dH2O至10 mL。按1.2.7步驟進行操作,以吸光度為縱坐標,蘆丁質量為橫坐標,繪制標準曲線,得出回歸方程。

1.2.7.3 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH體系比色法方法學評價 對NaNO2-Al(NO3)3-NaOH體系比色法精密度、重現性、穩定性及加標回收率進行測定。根據1.2.6拉曼光譜快速檢測方法學評價試驗進行操作,所有試驗均重復三次,取平均值。

1.3 數據處理

本試驗數據主要采用Microsoft Office Excel和Origin 7.5軟件進行數據處理和作圖分析。

2 結果與分析

2.1 拉曼光譜快速檢測方法實驗結果

2.1.1 拉曼特征峰確定 731 cm-1處為山西老陳醋醋泥中黃酮類物質拉曼特征峰[21-23]。由圖1可見,醋泥試樣中黃酮類物質拉曼峰相對于蘆丁峰位置發生了偏移,其原因可能是醋泥中所含物質為蘆丁衍生物,且混合物中各物質之間存在相互影響,導致拉曼特征峰位置發生一定程度偏移。

圖1 拉曼特征峰的選取Fig.1 Selection of Raman characteristic peaks

2.1.2 拉曼光譜快速檢測方法標準曲線的建立 根據1.2.4步驟進行操作,建立的標準曲線,回歸方程為y=76.73575x+32.93431,R2=0.86903,結果表明,在特征峰位置處,蘆丁濃度與拉曼峰強度之間呈良好的線性關系。

2.1.3 最佳檢測條件確定

2.1.3.1 積分時間確定 由圖2可見,當積分時間為25 s時,其拉曼特征峰處拉曼強度最大。其原因可能是當積分時間小于25 s時,隨激光照射時間的延長,所產生的拉曼效應愈明顯,當激光照射時間達到一定閾值點后,所產生的熱效應對老陳醋醋泥中黃酮類物質有一定程度破壞,使得拉曼效應降低。因此,選擇25 s為最佳積分時間。

圖2 積分時間的優化Fig.2 Optimization of integration time

2.1.3.2 激光功率確定 由圖3可見,隨激光功率不斷增大,在特征峰處拉曼強度也持續上升。當激光功率為350 mW時,特征峰強度達到最大,峰最明顯。其原因可能是黃酮類物質拉曼信號很弱,需要足夠強的激光功率照射才能得出良好的圖像。因此,選擇350 mW為最佳激光功率。

圖3 激光功率的優化Fig.3 Optimization of laser power

2.1.3.3 積分次數確定 由圖4可見,不同積分次數在特征峰位置處所產生的拉曼特征峰基本重疊,可見積分次數對拉曼圖像影響較小,因此選擇積分次數最少,即5次為宜。

圖4 積分次數的優化Fig.4 Optimization of integration times

2.1.4 拉曼光譜快速檢測方法評價 根據1.2.6拉曼光譜快速檢測方法學評價實驗,對同一樣品連續測定五次,測得特征峰峰強分別為361.99、333.92、276.81、379.59、336.62,計算得出RSD值為7.82%,說明準確度較高;測定5組相同樣品,測得特征峰峰強分別為310.77、318.24、352.72、302.11、326.12,計算得出RSD值為4.33%,說明重復性較好;對一個樣品測定5次,每次間隔30 min,測得特征峰峰強分別為336.93、354.22、316.21、341.19、332.61,計算得出RSD值為4.11%,說明穩定性較高;對已知濃度的總黃酮溶液加標,其測定結果如表1所示。

表1 拉曼光譜快速檢測方法的加標回收率Table 1 The recovery rate of the method of Raman fast detection

2.2 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH體系比色法實驗結果

2.2.1 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH體系比色法標準曲線的建立 根據1.2.7.1步驟建立的標準曲線方程為y=0.4287x+0.0034,其中y為吸光度,x為蘆丁的質量,R2=0.9973,表明二者線性關系良好。

2.2.2 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH體系比色法評價 根據1.2.7.2 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH體系比色法評價試驗結果計算得出,該方法的精密度、重現性、穩定性的RSD值分別為0.55%,2.98%,5.31%,平均回收率為97.99%,表明該方法精密度很高,重現性、穩定性都較好,加標回收率也較高,方法可行。

2.3 方法比較

拉曼光譜快速檢測方法與比色法結果比較如表2所示。與比色法相比較而言,拉曼光譜快速檢測方法精密度及重現性均較差,但穩定性及加標回收率相對更高。從整體來看,新建立的拉曼光譜快速檢測方法滿足了一線檢測的要求,可以實現現場快速檢測。

表2 拉曼光譜快速檢測方法與比色法比較Table 2 Comparison between the method of Raman fast detection and colorimetry

3 結論與展望

本試驗建立了山西老陳醋醋泥中總黃酮拉曼光譜快速檢測方法,確定總黃酮拉曼特征峰在731 cm-1處。通過拉曼條件優化試驗,確定積分時間為25 s,激光功率為350 mW,積分次數為5次,此條件下進行測定,其拉曼特征峰最為明顯。通過拉曼方法評價試驗,結果顯示其精密度、重現性、穩定性的RSD值分別為7.82%、4.33%、4.11%,平均加標回收率為98.75%。雖然與NaNO2-Al(NO3)3-NaOH體系比色法相比,其精密度及重現性較差,可靠性較低,但同時也表明該方法穩定性及加標回收率較好?？傮w而言,新建立的拉曼光譜快速檢測方法達到了快速檢測要求,可以實現現場快速檢測。

本試驗旨在通過建立山西老陳醋醋泥中總黃酮拉曼光譜快速檢測方法,拓展拉曼檢測儀的適用范圍,為實現山西老陳醋拉曼光譜快速檢測提供方法依據,為進一步實現山西老陳醋現場快速檢測奠定基礎。由于老陳醋醋泥中存在大量熒光物質對便攜式拉曼檢測儀干擾極大,如醇溶性蛋白等。所以,進一步試驗中不僅需要在后期運用數學方法消除熒光背景,而且前期也要盡可能減少熒光干擾?？梢試L試使用如大波長激光頭或傅里葉變換拉曼等方法來消除熒光對實驗結果的干擾。不斷完善譜庫,增強方法研究,提高拉曼快速檢測技術的檢出性能,便于更多新物質檢測,這也是后續試驗將要進一步研究的工作[24]。