天麻普通粉、破壁粉、凍干粉對戊四唑誘導驚厥大鼠海馬組織GABA-T mRNA及蛋白表達的影響

1.貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550025；2.張家口市第五醫院，河北 張家口 075000；3.貴州廣濟堂藥業有限公司，貴州 貴陽 550014

驚厥是由多種原因引起的中樞神經系統過度興奮，導致神經細胞異常運動，臨床表現為對稱性、全身性和陣發性的肌肉抽動，伴有眼球上翻、意識障礙，主要好發于兒童的一類神經疾病[1]。驚厥發病機制復雜，通常以神經遞質之間的平衡紊亂為主。神經遞質包括抑制性和興奮性神經遞質，γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是抑制性神經遞質，在抗驚厥方面發揮重要作用[2]。GABA受γ-氨基丁酸轉氨梅(γ-aminobutyrate transaminase,GABA-T)催化降解，GABA-T活性增強已成為驚厥發病的一個重要因素[3-4]。天麻化學成分含有天麻素、天麻甘元、香莢蘭醇多糖等，其活性成分主要以酚類及多糖為主，具有抗驚厥、保護神經細胞、鎮痛、鎮靜、抗衰老等藥理作用[5]。破壁粉碎技術是將傳統飲片加工粉碎至D90<45 μm的粉體，無需添加任何輔料制成中藥破壁飲片，提高生物利用度的一種技術[6]。凍干技術是將中藥材在真空狀態下冷凍，通過水的升華除去水分，已被國家列入“21世紀中醫藥現代化發展戰略”之一的一種干燥技術[7]。研究以大鼠為對象，探討天麻(普通粉、破壁粉、凍干粉)對戊四唑誘導驚厥大鼠海馬組織GABA-T mRNA及蛋白表達的影響，初步探討不同工藝的天麻治療驚厥的療效和作用機制，為后期臨床和實驗研究使用天麻破壁粉和凍干粉提供實驗依據。

1 儀器與材料

1.1 動物 72只清潔級SD大鼠，體重為(200±20)g，購自于慶騰鑫比爾實驗動物銷售有限公司，動物許可證號：SCXK(軍)2012-0011。

1.2 藥物 天麻來源為自采，經貴州中醫藥大學植物栽培教研室魏升華教授鑒定為蘭科植物天麻GastrodiaelataBl.的干燥塊莖。普通粉：60 ℃中烘干，研磨粉碎后過6號篩制成；破壁粉：60 ℃中烘干，應用破壁粉碎技術加工、干壓制成粉粒；凍干粉：真空干燥機將切制、滅菌的新鮮天麻凍干，小鋼磨粉碎后，最后過藥典6號篩篩選制成。

1.3 試劑 丙戊酸鈉(批號：8HG0385，賽諾菲制藥有限公司)；戊四唑 (批號：#L16185，深圳市華宇能通訊科技有限公司)；TRNzol總RNA提取試劑(批號：DP405-02，天根生化科技(北京)有限公司)；DL2000 DNA Marker(批號：3427Q，寶日醫生物技術有限公司)；Ultrapure RNA Kit(批號：CW0581M，北京康為世紀生物科技有限公司)；HiScript II One Step qRT-PCR SYBR Green Kit(批號：Q221-01，南京諾唯贊生物科技有限公司)；一步法快速WB(HRP)試劑盒(兔)(批號：CW02029)、一步法快速WB(HRP)試劑盒(鼠)(批號：CW02030)、BCA蛋白定量試劑盒(批號：CW0014)均購自北京康為世紀生物科技有限公司。

1.4 儀器 Step One Plus型熒光定量PCR儀(美國應用生物系統公司)；C2500型低溫離心機(湖南湘儀實驗儀器廠)；ZS-2型板式酶標儀(北京新風機電有限公司)；164-5050型電泳儀(伯樂生命醫學產品有限公司)；Mini-PROTEAN Tetra Electrophoresis System型蛋白電泳槽(伯樂生命醫學產品有限公司)；Mini Trans-Blot型蛋白轉印系統(伯樂生命醫學產品有限公司)；Tanon 1600型凝膠成像系統(上海天能科技有限公司)。

2 方法

2.1 分組 72只健康成年SD大鼠，將大鼠適應性養7 d，隨機分為12組，每組6只，然后稱重、標記。分組：正常組，模型組(戊四唑)，陽性對照組(丙戊酸鈉)組，天麻普通粉低、中、高劑量組(0.5 g/kg、1.0 g/kg、2.0 g/kg)，天麻破壁粉低、中、高劑量組(0.5 g/kg、1.0 g/kg、2.0 g/kg)，天麻凍干粉低、中、高劑量組(0.5 g/kg、1.0 g/kg、2.0 g/kg)。

2.2 造模及給藥 正常對照組用生理鹽水灌胃(4 mL/kg)；模型組用戊四唑腹腔內注射(0.08 g/kg)；陽性對照組戊四唑腹腔內注射 (0.08 g/kg)，再給予丙戊酸鈉灌胃(0.12 g/kg)，持續10 d；藥物組戊四唑腹腔內注射 (0.08 g/kg)，分別給予天麻(普通粉、破壁粉、凍干粉)低、中、高劑量組(0.5 g/kg、1 g/kg、2 g/kg)灌胃，使藥物均勻溶解，連續給藥10 d，并給予適宜環境生長，自由進水進食。在給藥之后把大鼠單獨放在鼠籠里并觀察大鼠30 min的形力學改變，驚厥診斷參照Racine標準記錄發作等級，選擇發作等級大于Ⅳ的進入下一步實驗。[8]

2.3 檢測指標

2.3.1 對戊四唑誘導驚厥大鼠GABA-T mRNA表達量的影響 按照超純RNA試劑盒說明從大鼠海馬組織制備總RNA，分光光度計測定總RNA濃度和純度，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，按cDNA反轉錄試劑盒說明進行逆轉錄。PCR擴增條件為95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火40 s，60 ℃延伸1 min，循環次數40個。目的基因作為引物和以GAPDH作為內參基因，引物列為GAPDH，上游引物序列5′-TTCCTACCCCCAATGTATCCG-3′，下游引物序列5′-CCACCCTGTTGCTGTAGCCATA-3′，擴增產物長度270 bp；GABA-T上游引物序列5′-CTTTCTGTTCTCAACTC-3′，下游引物序列5′-TGAATACTCTGCCCTGCTCT-3′，擴增產物長度138 bp。PCR實驗需重復3次，每次3個復孔，根據Real-time PCR原始數據Ct值，并計算相對定量值。

2.3.2 對戊四唑誘導驚厥大鼠海馬組織樣本中GABA-T蛋白表達量的影響 稱取適量大鼠海馬組織加入適量RIPA(細胞裂解液)裂解液勻漿后，10000 rpm離心20 min，然后取上清液，按BCA 試劑盒測定蛋白濃度。在凝膠電泳槽中加入制備好的蛋白樣品，轉膜，取膜。封閉液封閉后，使一抗與二抗充分混勻，于室溫條件下孵育5 min，加入一步法抗體稀釋液(一抗GABA-T濃度(1∶1000)、二抗GABA-T濃度(1∶200)，一抗內參β-actin濃度(1∶5000)、二抗內參β-actin濃度(1∶200)。混勻，放入PVDF(聚偏氟乙烯)膜，ECL(電致化學發光)化學發光試劑顯色，開始曝光。掃描膠片并保存，凝膠成像系統對各組數據進行分析。目的蛋白表達量與同一樣本內參表達量之比可以計算出目的蛋白相對表達量。

3 結果

3.1 戊四唑誘導驚厥大鼠海馬組織GABA-T mRNA表達量的變化 與正常組比較，模型組GABA-T mRNA相對表達量顯著上升(P<0.05)；與模型組比較，陽性藥對照組和不同工藝的天麻組均可顯著降低GABA-T mRNA相對表達量(P<0.05)，在一定范圍內呈量效關系，且天麻凍干粉高劑量組與陽性對照組的GABA-T mRNA表達無明顯差異(P>0.05)。天麻凍干粉中劑量組對GABA-T mRNA表達的抑制作用高于天麻破壁粉高劑量組(P<0.05)。見表1。

組別劑量/g/kgGABA-TmRNA正常組-1.00±0.08模型組0.084.33±0.191)陽性對照組0.122.63±0.421)2)天麻普通粉低劑量組0.54.11±0.301)3)天麻普通粉中劑量組13.65±0.061)2)3)天麻普通粉高劑量組23.38±0.241)2)3)天麻破壁粉低劑量組0.53.93±0.481)3)天麻破壁粉中劑量組13.42±0.521)2)3)天麻破壁粉高劑量組22.94±0.691)2)天麻凍干粉低劑量組0.53.66±0.441)2)3)天麻凍干粉中劑量組12.89±0.481)2)天麻凍干粉高劑量組22.67±0.501)2)

注：與正常組比較，1)P<0.05；與模型組比較，2)P<0.05；與陽性對照組比較，3)P<0.05。

3.2 戊四唑誘導驚厥大鼠海馬組織GABA-T蛋白表達量的變化 與正常組比較，模型組GABA-T蛋白相對表達量顯著提高(P<0.05)；與模型組比較，陽性對照組和不同工藝的天麻組均可不同程度降低GABA-T蛋白相對表達量(P<0.05)。相同劑量下，天麻因加工工藝不同對大鼠海馬組織GABA-T蛋白表達量也不同，整體蛋白表達量呈現：普通粉>破壁粉>凍干粉。見圖1、2。

4 討論

驚厥是以神經細胞反復放電、大腦功能暫時性失常為特征的神經系統疾病。廣泛分布于腦內的GABA作為抑制性神經遞質在抗驚厥中發揮著重要作用，GABA經谷氨酸合成，通過GABA-T催化生成琥珀酸半醛，琥珀酸半醛在琥珀酸半醛脫羧酶的催化下生成琥珀酸，進入三羧酸循環，GABA-T是GABA的代謝過程中的關鍵酶[9]。研究表明，GABA-T抑制劑可以提高機體腦內的GABA濃度，且這類抑制劑對驚厥機體大腦有高度選擇性作用，所以GABA-T可以作為治療驚厥的一個重要靶點[10]。目前驚厥的治療集中于對癥治療和控制療法，難于對因治療和根治，臨床療效較差，西醫藥物治療一般使用苯二氮卓類、苯巴比妥類等藥物，但不良反應較多。天麻具有祛風止痙、平肝熄風等功效，其在改善驚厥的臨床癥狀、恢復神經細胞功能、延長發作間歇期、減少復發等方面占有獨特優勢[11]。抗癇膠囊(主要藥物含有天麻)可以明顯降低GABA-T的活性而達到治療驚厥的作用[12]。

天麻破壁粉是利用現代超微粉碎技術將傳統飲片粉碎成D90<45 μm的粉體，以不同濃度的乙醇或水作為黏合劑制成30～100目的一種新型飲片。中藥飲片發揮治療作用的基礎主要是藥物中的有效活性成分，但大多藥物的活性成分在細胞內部。當天麻經破壁技術加工后，其細胞壁被打破，提高天麻在體內的釋放速度和吸收程度；天麻粒徑減小、表面積增大，提高有效成分的溶出，因此與傳統飲片相比更利于細胞內的有效成分的釋放，從而大大提高了藥物活性成分的溶出率[13]。鄧銀愛等[14]研究在大鼠體內藥代動力學變化，黃芪破壁飲片的生物利用度較黃芪傳統飲片高。林偉波[15]研究參芪固本方對大腸癌化療后造血系統改善作用，發現同等劑量時破壁飲片療效明顯優于傳統飲片。

天麻凍干粉是將其在低溫條件下經現代提取工藝制備而成的新劑型，其制備過程中隔絕空氣。因此凍干技術有效地抑制了熱敏性物質發生生物、化學或物理變化，保存了天麻的活性物質，使天麻成分穩定性增高，不易發生化學變質，改善了鮮天麻不易保存的缺點[16]。研究表明，新鮮天麻經過真空冷凍干燥工藝研究，其天麻素保留率可達0.67%。陳艷芬等[17]在研究決明子配方顆粒的藥效學，結果顯示決明子配方顆粒藥效總體優于傳統水煎液，其中以冷凍顆粒藥效最好。張興盈[18]在不同加工工藝的云當歸抗凝血作用比較中，發現真空干燥成的凍干云當歸抗凝血作用比其它加工工藝(鼓風干燥、微波干燥、自然曬干)的云當歸效果好，同等劑量時其利用率提高。

研究發現，天麻凍干粉中劑量組對GABA-T mRNA表達的抑制作用高于天麻破壁粉高劑量組(P<0.05)；同等劑量下，天麻破壁粉對GABA-T mRNA及蛋白表達的抑制作用高于天麻普通粉。因此，天麻破壁粉、凍干粉均能提高對驚厥大鼠海馬組織神經細胞的保護作用，且整體效果呈現凍干粉的效果優于破壁粉，破壁粉的效果優于普通粉，其作用機制可能是不同加工工藝的天麻調節GABA-T mRNA及蛋白表達的差異與天麻粉碎粒徑大小和干燥方式有關，本研究為天麻凍干粉、破壁粉的臨床應用提供理論和實驗基礎。但不同干燥和粉碎技術對天麻抗驚厥有效成分的差異性，有待進一步研究證實明確。