白藜蘆醇苷的體外抗氧化活性研究

泰州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 泰州 225300

白藜蘆醇苷(polydatin，PD)即3,4′5-三羥基-3-β-D-吡喃葡萄糖苷，是傳統(tǒng)中藥虎杖中的有效成分，具有抗癌、抗凋亡、調(diào)控細(xì)胞增殖與自噬等藥理活性[1-2]，另外，白藜蘆醇苷能夠通過(guò)抗炎進(jìn)而發(fā)揮對(duì)心血管系統(tǒng)的保護(hù)作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)，多種心血管疾病都伴隨著氧自由基的過(guò)量生成，并且機(jī)體過(guò)度氧化應(yīng)激能夠參與心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展[4-5]。因此，應(yīng)用抗氧化活性物質(zhì)、增強(qiáng)機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)，改善機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)，可能成為心血管疾病新的治療靶向。研究以白藜蘆醇苷為研究對(duì)象，考察其體外抗氧化活性，以期為白藜蘆醇苷的心血管疾病保護(hù)作用提供一定的理論基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 752型紫外可見分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司)；MS204TS型分析天平(梅特勒-托利多上海有限公司)。

1.2 材料 白藜蘆醇苷(批號(hào)：15721)、1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH，批號(hào)：D9132)、1,10-菲羅啉(批號(hào)：GG240128)均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；鐵氰化鉀(批號(hào)：DF230103)、硫酸亞鐵(批號(hào)：GD260142)、硫代巴比妥酸(批號(hào)：FA090131)、三氯乙酸(批號(hào)：DG100100)購(gòu)自薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司；乙醇(批號(hào)：20180706)、H2O2(批號(hào)：20180615)為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，所有均為分析純。

2 方法

2.1 白藜蘆醇苷對(duì)羥基自由基清除能力的測(cè)定 取2.1 mM 1,10-菲羅啉溶液1 mL置入試管中，加入2 mL磷酸鹽緩沖溶液(PBS)和1 mL雙蒸水混勻，再加入1 mL硫酸亞鐵溶液混勻，最后加入1 mL H2O2溶液，37 ℃溫育60 min，在536 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，為A(損)；用1 mL蒸餾水代替H2O2，測(cè)的吸光度值為未損傷管A(未)；用不同濃度樣品溶液代替雙蒸水，測(cè)出的吸光度為A(樣)。

清除率(%)=[A(樣)-A(損)]/[A(未)-A(損)]×100

2.2 白藜蘆醇苷對(duì)DPPH自由基清除能力的測(cè)定 取不同濃度樣品溶液2 mL和DPPH·溶液2 mL加入到試管中搖勻、室溫靜置30 min，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值 Ai；在2 mL DPPH·標(biāo)準(zhǔn)溶液中加入2 mL無(wú)水乙醇，震蕩混合，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值A(chǔ)0；試管中加入2 mL不同濃度的樣品溶液和2 mL無(wú)水乙醇，搖勻、避光放置30 min后，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值A(chǔ)j。

清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

2.3 白藜蘆醇苷對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化物抑制作用的測(cè)定 新鮮雞蛋去卵清，卵黃用等體積的PBS緩沖液配制成1∶1的卵黃懸液，同方向勻速攪拌10 min，再用PBS稀釋成1∶25的卵黃懸液。吸取卵黃懸液 0.2 mL，分別加入0.1 mL不同濃度樣品溶液，0.2 mL 25 mM硫酸亞鐵溶液，加入1.5 mL PBS緩沖液，在37℃水浴下反應(yīng)30 min，加1 mL 20%三氯乙酸，混勻3500 r/min離心15 min，取上清液2 mL，加1 mL 0.8%硫代巴比妥酸溶液，沸水浴15 min冷卻后532 nm下測(cè)定吸光度值，以0.1 mL蒸餾水代替樣品作為空白對(duì)照管。

清除率=(A0-A)/A0×100%；其中，A0為空白對(duì)照管吸光度，A為樣品吸光度。

2.4 白藜蘆醇苷還原鐵離子能力的測(cè)定 在試管中加入0.5 mL樣品溶液，2.5 mL的PBS緩沖液和2.5 mL鐵氰化鉀溶液，震蕩均勻，50℃水浴20 min，流水冷卻，然后加入2.5 mL三氯乙酸溶液。混勻后，用3000 r/min離心10 min。吸取上清液2.5 mL置于新的離心管中，再加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL三氯化鐵溶液，混合均勻后，用紫外分光光度計(jì)在700 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。吸光度越大表明樣品還原能力越強(qiáng)。

3 結(jié)果

3.1 白藜蘆醇苷對(duì)羥基自由基清除的影響 機(jī)體過(guò)量的自由基則會(huì)引起蛋白質(zhì)變性、酶失活、多糖降解、DNA鏈斷裂、生物膜結(jié)構(gòu)損傷、細(xì)胞解體乃至機(jī)體病變和死亡。從圖1可知，隨著白藜蘆醇苷濃度增加，其對(duì)羥基自由基的清除率逐漸增大，提示白藜蘆醇苷具有一定的清除羥基自由基的作用。

3.2 白藜蘆醇苷對(duì)DPPH·自由基清除的影響 DPPH自由基溶液在517 nm處有強(qiáng)吸收，每個(gè)DPPH分子在溶液中可生成一個(gè)穩(wěn)定的含氮自由基，具有典型紫色，當(dāng)它與提供1個(gè)電子的自由基清除劑作用時(shí)，生成無(wú)色產(chǎn)物，使溶液的典型紫色變淺。由圖2可知，隨著白藜蘆醇苷濃度的增加，其對(duì)DPPH自由基的清除率增大。當(dāng)白藜蘆醇苷濃度為0.5 mg/mL時(shí)，DPPH 自由基清除率為48.05%，揭示白藜蘆醇苷具有一定的體外抗氧化活性。

3.3 白藜蘆醇苷對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化物抑制作用的影響 過(guò)氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)生的丙二醛，與硫代巴比妥酸發(fā)生縮合反應(yīng)生成紅色產(chǎn)物，在 532 nm處有最大吸收。隨著白藜蘆醇苷濃度的增加，白藜蘆醇苷對(duì)卵黃脂蛋白體系中脂質(zhì)過(guò)氧化作用抑制率也隨之增加，其抑制作用與白藜蘆醇苷濃度呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。從圖3可知，白藜蘆醇苷對(duì)卵黃脂蛋白脂質(zhì)過(guò)氧化物具有一定的抑制作用。

3.4 白藜蘆醇苷還原鐵離子能力的測(cè)定 一般情況下，物質(zhì)的還原能力與其抗氧化能力成正比，還原能力強(qiáng)的物質(zhì)可作為電子供體，使自由基變成穩(wěn)定形態(tài)，從而起到抗氧化的作用。在該反應(yīng)過(guò)程中，F(xiàn)e3+可被抗氧化物質(zhì)還原成為Fe2+后在700 nm波長(zhǎng)下具有強(qiáng)吸收。因此，吸光度越大表明樣品還原能力越強(qiáng)。由圖4可知，隨著白藜蘆醇苷濃度的增加，體系吸光度越大，表明白藜蘆醇苷具有一定的還原力。

4 討論

羥基自由基、過(guò)氧化氫及超氧陰離子自由基等是生物體內(nèi)主要的活性氧自由基，它們引發(fā)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化是機(jī)體衰老、動(dòng)脈粥樣硬化、心血管疾病及腫瘤發(fā)生的重要原因。因此，有關(guān)抗氧化清除自由基的作用以及天然抗氧化活性小分子化合物篩選得到普遍的關(guān)注。研究從白藜蘆醇苷對(duì)羥基自由基和DPPH·自由基的清除作用，對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化物的抑制作用和鐵離子的還原能力4個(gè)方面對(duì)白藜蘆醇苷的體外抗氧化進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，白藜蘆醇苷能夠清除羥基自由基和DPPH自由基，并且具有一定的脂質(zhì)過(guò)氧化物抑制和鐵離子還原能力。因此，白藜蘆醇苷具有一定的體外抗氧化活性，可能作為潛在的抗氧化劑。

有研究表明，氧化應(yīng)激在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[6]。本實(shí)驗(yàn)表明，白藜蘆醇苷在體外具有一定的抗氧化活性，這可能為揭示白藜蘆醇苷的心血管疾病保護(hù)作用提供一定新的理論基礎(chǔ)。