不同前處理方法對補骨膠囊鈣含量測定影響的對比研究

1.貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550025；2.貴州廣濟堂藥業有限公司，貴州 貴陽 550014；3.貴州中醫藥大學第一附屬醫院，貴州 貴陽 550001；4.貴州省食品藥品檢驗所，貴州 貴陽 550004

伴隨著社會的進步，人口老齡化問題愈發嚴重。骨質疏松的發病率呈逐年上升趨勢，并引起了社會的廣泛關注[1-2]。為改善人群骨健康狀態，本課題組研制開發以增加骨密度、防治骨質疏松為主要功能的保健食品補骨膠囊。處方中中藥骨碎補、杜仲、鹿骨粉已被國家衛生健康委員會列為可用于保健食品的中藥名單，再與現代常用增加骨密度的營養補充劑骨膠原蛋白粉、碳酸鈣、維生素D3相結合，增強產品防治骨質疏松的功能。鈣作為維持骨骼韌性和提供骨骼營養的重要物質，是人體必需的成分，對處方增加骨密度，防止骨質疏松的功能有一定的輔助作用，同時，保健食品中鈣的含量也是影響產品質量的重要指標[3]。因此根據國家食品藥品監督管理局頒布的《保健食品注冊與備案管理辦法》相關規定，對處方中功效成分鈣進行含量測定，以保證產品質量可控。

參考《食品安全國家標準食品中鈣的測定》[4]中火焰原子吸收法光譜法建立補骨膠囊中鈣含量測定方法。現行鈣含量測定標準中樣品前處理方法包含微波消解、濕法消解、干法灰法等方法[5-9]，在處理過程中，標準中對于未消解完全的樣品采用再次消解進行處理，但對于難于消解的，如膠類等，采用多次消解，消解不完全，消解液有顏色、沉淀，對檢測結果干擾較大，檢測時易堵塞進樣系統，對儀器影響大。本試驗針對此類問題，進行了摸索，在樣品消解過程中，加入適量的30%過氧化氫，使其消解后樣品顏色澄清、無沉淀，減少雜質干擾，樣品完全消解。本文通過火焰原子吸收法光譜法比較微波消解、濕法消解、干法灰法三種樣品前處理方法對補骨膠囊樣品消解完全進行對比分析研究，從而建立補骨膠囊最佳鈣的含量測定樣品前處理方法，為該制劑的質量穩定、可控提供有力依據，并為相關保健食品中鈣的含量測定方法提升提供研究依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器 AA800原子吸收光譜儀(美國PE公司)、MARS-X微波消解儀(美國瑪氏公司)、SX-4-10型箱式電阻爐控制箱(天津市泰斯特儀器有限公司)、BHW-09C可調式電爐(上海博通化學科技有限公司)、ABZ04-S型電子天平(上海梅特勒有限公司)。

1.2 試藥 補骨膠囊(批號：20180510、2018-0511、20180512)、碳酸鈣對照品(上海麥克林生化科技有限公司，純度為99.99%，批號：20140424)、氧化鑭(上海躍龍化工廠，分析純，批號：Q/12HB 3875-2009)、硝酸(上海沃凱生物技術有限公司，優級純，批號：20170623)、鹽酸(國藥集團化學試劑有限公司，優級純，批號：20100428)、高氯酸(國藥集團化學試劑有限公司，優級純，批號：20120626)、30%過氧化氫(上海沃凱生物技術有限公司，優級純，批號：20170623)、水為實驗室自制超純水。

2 方法與結果

2.1 測定方法 參考《食品安全國家標準食品中鈣的測定》，采用火焰原子吸收光譜法測定本品鈣的含量。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取碳酸鈣2.4963 g，加適量鹽酸溶液(1+1)溶解，置干燥的1000 mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻，即得鈣標準儲備溶液(C=1000 mg/L)。準確吸取鈣標準儲備溶液10 mL置干燥的100 mL容量瓶中，用硝酸溶液(5+95)定容至刻度，搖勻，即得鈣標準中間溶液(C=100 mg/L)。

2.3 供試品的制備

2.3.1 微波消解 取補骨膠囊內容物研細，精密稱取0.2 g于微波消解罐中，加入5 mL硝酸，浸泡過夜。置微波消解儀進行消解(消解參考條件：120 ℃升溫5 min，恒溫15 min；160 ℃升溫5 min，恒溫20 min；190 ℃升溫5 min，恒溫35 min)，冷卻后取出消解罐，在可調式電爐趕酸(趕酸參考條件：140 ℃/1h、升至150 ℃/1h、升至160 ℃)，消化液趕酸至1 mL左右，顏色呈無色透明，若消化液顏色較深，再加5 mL硝酸，1 mL 30%過氧化氫繼續消解、趕酸。趕酸結束后，取出消解罐，放冷，用水潤洗消解罐3次，合并洗液至25 mL容量瓶中，用水定容至刻度，即得供試品消解液。根據所需濃度，精密量取供試品消解液0.05 mL，置干燥的50 mL容量瓶中，同時加入2.5 mL 20 g/L鑭溶液，混合均勻，用水定容至刻度，使鑭在其稀釋液中的濃度為1 g/L，即得供試品稀釋液，待用。同法做試劑空白溶液。

2.3.2 濕法消解 取補骨膠囊內容物研細，精密稱取0.2 g于消化管中，加入10 mL硝酸及0.5 mL高氯酸，浸泡過夜。在可調式電爐消解(消解參考條件：120 ℃/1h、升至180 ℃/3h、升至210 ℃)，消化液消解至1 mL左右，顏色呈無色透明或略帶黃色，若消化液顏色較深，在加10 mL硝酸繼續消解。消解結束后，取出消化管，放冷，用水潤洗消化管3次，合并洗液至25 mL容量瓶中，用水定容至刻度，即得供試品消化液。根據所需濃度，精密量取供試品消化液0.05 mL，置干燥的50 mL容量瓶中，同時加入2.5 mL 20 g/L鑭溶液，混合均勻，用水定容至刻度，使鑭在其稀釋液中的濃度為1 g/L，即得供試品稀釋液，待用。同法做試劑空白溶液。

2.3.3 干法灰化 取補骨膠囊內容物研細，精密稱取0.2 g置坩堝中，小火加熱，炭化至無煙，轉移至馬弗爐中，與550 ℃灰化4 h，樣品呈白灰狀，冷卻，取出，用適量硝酸溶液(1+1)溶解轉移至25 mL容量瓶中，用水潤洗坩堝3次，合并洗液至容量瓶中，用水定容至刻度，即得供試品消化液。根據所需濃度，精密量取供試品消化液0.05 mL，用水定容至50 mL容量瓶中，同時加入2.5 mL 20g/L鑭溶液，混合均勻，用水定容至刻度，使鑭在其最終稀釋液中的濃度為1 g/L，即得供試品稀釋液，待用。同法做試劑空白溶液。

2.4 儀器條件 波長：422.7 nm；狹縫：0.7 nm；燈電流：10 mA；燃燒頭高度：3 mm；空氣流量：10 L/min；乙炔流量：2 L/min。

2.5 方法學考察

2.5.1 線性關系考察 分別吸取“2.2”項下鈣標準中間溶液0 mL、0.5 mL、1 mL、2 mL、4 mL、6 mL于100 mL容量瓶中，同時在各容量瓶中加入5 mL 20 g/L鑭溶液，分別加(5+95)硝酸溶液定容，混勻。配制鈣標準系列溶液中鈣的質量濃度分別為0 mg/L、0.500 mg/L、1.00 mg/L、2.00 mg/L、4.00 mg/L、6.00 mg/L。分別取適量溶液注入儀器，按“2.4”項下儀器條件測定。以濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，計算回歸方程為：y=0.0289x-0.00005，r=1。結果表明，鈣在0～6.00 mg/L范圍內線性關系良好。鈣標準曲線，如圖1所示。

2.5.2 精密度試驗 取補骨膠囊內容物研細，精密稱取0.2 g，分別按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.4”項下儀器條件測定，分別連續進樣6次，計算樣品中鈣的含量及RSD。結果表明，微波消解、濕法消解、干法灰化測定鈣的含量分別為：258.17 mg/g、273.81 mg/g、261.45 mg/g，RSD分別為：0.72%、0.15%、0.76%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 重復性試驗 取補骨膠囊內容物研細，精密稱取0.2 g，各六份，分別按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.4”項下儀器條件測定，計算樣品中鈣的含量及RSD。結果表明，微波消解、濕法消解、干法灰化測定鈣的含量分別為：273.91 mg/g、278.78 mg/g、276.47 mg/g，RSD分別為：2.02%、4.35%、6.27%。結果表明，微波消解處理樣品的方法較濕法消解、干法灰化的重復性好。

2.5.4 加樣回收試驗 根據上述考察結果，選取微波消解樣品處理方法進行加樣回收率試驗。取已知含量的樣品6份，每份精密稱定0.1 g，分別精密量取碳酸鈣對照品溶液27500.0 mg/L 1 mL，按“2.3.1”項下方法制備供試品溶液，共六份，按“2.4”項下儀器條件測定，記錄濃度，計算樣品加樣回收率及RSD。結果表明，平均加樣回收率為99.0 %，在回收率限度95%～102%之間，RSD在2 %以內，該含量測定方法回收率較好，符合測定要求。結果見表1。

表1 鈣回收率試驗結果

3 討論

3.1 鈣含量檢測方法的比較 現測定鈣含量的檢測方法主要有EDTA滴定法、火焰原子吸收光譜法、電感耦合等離子體質譜法(ICP-MS)等方法。由于ICP-MS普及度不高，儀器使用條件較高，對樣品檢測結果產生一定的誤差。EDTA滴定法具有快速、簡便等優點常作為首選檢測方法[10-11]。本試驗最先采用EDTA滴定法檢測補骨膠囊中鈣的含量，試驗中發現EDTA滴定法適用于干擾少的樣品，但如果樣品組成復雜，在滴定時易出現絡合物，造成干擾[12-14]。當試驗采用火焰原子吸收光譜法檢測補骨膠囊中鈣的含量較EDTA滴定法結果準確可靠、檢測過程干擾小、簡單、快速的優點。

3.2 樣品消解方法對比及優化 通過火焰原子吸收法光譜法比較微波消解、濕法消解、干法灰法三種樣品前處理方法對補骨膠囊樣品消解完全進行對比分析研究。試驗發現，微波消解、濕法消解、干法灰化三種消解方法中，微波消解比其余兩種消解法重復性較好。濕法消解在消化樣品時，需加高氯酸強酸強腐蝕強刺激試劑，若前期樣品低溫消解時有機物消化不完全，遇高氯酸劇烈反應，易噴濺、爆炸，會對操作人員安全造成極大威脅，其樣品消化時間長，誤差較大，樣品檢測后鈣含量重復性差。干法灰化消解樣品時不易消化完全，炭化樣品時，容易造成樣品污染，樣品在測試過程中造成檢測數據的波動，其鈣含量重復性較差[7]。采用微波消解方法處理樣品時，具有速度快，污染少，樣品消化完全等特點，結果更加準確可靠[15]。

在試驗過程中，因處方中骨膠原蛋白含有一定的膠類物質，不易消解完全，影響鈣的含量；消解液不易消解成無色透明狀態，影響測定時吸光度變化，故在消解過程中加入適量30%的過氧化氫，可使樣品消解完全，減少雜質干擾。

4 結論

綜上所述，本試驗選擇微波消解作為樣品前處理方法，方法操作簡便，對樣品消解完全。應用該方法處理補骨膠囊，進行鈣的含量測定，其結果穩定，方法可行，可有效控制補骨膠囊的質量。