HPLC法測定中偏康合劑中黃芪甲苷的含量

1.云南省執(zhí)業(yè)藥師注冊中心，云南 昆明 650101 ；2.云南省曲靖市第一人民醫(yī)院，云南 曲靖 655000；3.云南健測檢驗檢測技術(shù)有限公司，云南 曲靖 655000

中偏康合劑為云南省曲靖市第一人民醫(yī)院制劑室研制的制劑，由黃芪、三七、當歸等組成，具有補氣、活血、化瘀、通絡(luò)等功效，主要用于氣虛絡(luò)塞、口眼歪斜、語言蹇澀、口角流涎、下肢瘺廢、小便頻數(shù)等癥。其中黃芪為君藥，首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為豆科植物膜莢黃芪或蒙古黃芪的干燥根，性溫，歸脾、肺經(jīng)，具有補氣升陽、生津養(yǎng)血、行滯通痹等功效。黃芪甲苷是黃芪的主要活性成分之一，具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、抗細胞凋亡、調(diào)節(jié)代謝、抗腫瘤等藥理作用[1]。2015版《中國藥典(一部)》以黃芪甲苷及毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量作為黃芪質(zhì)量評價指標[2]。中偏康合劑所含成分復(fù)雜，現(xiàn)行版質(zhì)量標準中僅以薄層色譜法鑒別其中三七、赤芍兩種藥材，不能完全體現(xiàn)藥品的質(zhì)量。為了更加有效對本藥進行質(zhì)量控制，本實驗參照文獻[2-7]，以黃芪甲苷為定量指標，采用HPLC-ELSD法進行中偏康合劑中黃芪甲苷含量測定方法，為中偏康質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 LC-2030C 3D高效液相色譜儀(島津)，ELSD-LTⅡ蒸發(fā)光檢測器，ME104電子分析天平，ME55電子分析天平。

1.2 材料 黃芪甲苷對照品(批號：110781-201616，純度為97.4%，中國食品藥品檢定研究院)，乙腈為色譜純，水為超純水，其他為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件Angilent ZORBAX C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為乙腈-水(32：68)，檢測器為蒸發(fā)光檢測器，流速1.0 mL·min-1，柱溫30 ℃，氮氣流速為350 kpa。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備 取本品25 mL，精密量取，置錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，加熱回流1 h，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密吸取續(xù)濾液25 mL，蒸干，殘渣加水20 mL使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次30 mL，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次，每次30 mL，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 對照品溶液的制備 取黃芪甲苷對照品(含量97.4%) 11.1756 mg，加甲醇溶解稀釋至25 mL，制成每1 mL含0.4354 mg對照品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按中偏康口服液的處方和制法，制成不含黃芪的藥液，再按供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。

2.3 專屬性實驗 取2.2項下制備的樣品溶液按照2.1的色譜條件分別進樣10 μL進行測定，結(jié)果顯示，色譜圖在黃芪甲苷對照品相應(yīng)保留時間處無吸收峰，表明陰性對照無干擾。

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取2.2.2黃芪甲苷對照品溶液5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL、30 μL進樣，按“2.1”色譜條件下測定，以進樣質(zhì)量的(X)為橫坐標，色譜峰面積(Y)為縱坐標進行計算指數(shù)，繪制標準曲線，得到標準曲線方程為Y=X1.52644*EXP(9.93932)。相關(guān)系數(shù)為0.9994。結(jié)果表明，黃芪甲苷對照品在2.177～13.062 μg范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.5 精密度考察 精密吸取2.2.2的黃芪甲苷對照品溶液20 μL，按“2.1”色譜條件下連續(xù)進樣6次，記錄色譜峰的峰面積，結(jié)果峰面積的RSD%為1.11% 。表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗 取中偏康口服液(曲靖市第一人民醫(yī)院，20171206)25 mL，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，平行操作6份，按“2.1”色譜條件下各進樣20 μL進行測定，記錄色譜峰的峰面積，計算結(jié)果含量的RSD為1.17%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗 取中偏康口服液(曲靖市第一人民醫(yī)院，20171206)25 mL，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，室溫放置，分別于0、2、8、24、32、48 h按“2.1”色譜條件下各進樣20 μL進行測定，記錄色譜峰面積，結(jié)果峰面積的RSD為1.84%，表明樣品在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 回收率試驗 精密吸取中偏康口服液(曲靖市第一人民醫(yī)院，20190118，含量0.24 mg/mL)12.5 mL，共6份，精密吸取黃芪甲苷對照品溶液(0.9039 mg/mL)3.0 mL，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液。按“2.1”色譜條件，精密吸取6份供試品溶液20 μL，注入液相色譜儀，測定，記錄峰面積，計算黃芪甲苷的平均加樣回收率，平均回收率為93.0%,回收率良好，RSD為1.25%，符合分析方法的要求。見表1。

2.9 含量測定取3批中偏康口服液，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”色譜條件測定，外標法計算各供試品溶液中黃芪甲苷的含量。見表2。

表1 黃芪甲苷加樣回收率測定結(jié)果

表2 中偏康口服液中黃芪甲苷的含量

3 討論

3.1 流動相選擇 先后考察了[7]甲醇-水(76∶24)及乙腈-水(32∶68)、(33∶67)、(36∶64)及流速分別為0.8 mL/min和1.0 mL/min，柱溫25℃、30℃、35℃的條件，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在乙腈-水(32∶68)作為流動相，流速為1.0 mL/min，柱溫為30℃的條件時，分離度良好，保留時間合適，且陰性對照溶液無干擾。

3.2 樣品制備方法選擇 分別考察超聲提取(30 min，60 min，120 min)和回流提取(30 min，60 min，120 min)兩種提取方法及不同溶劑(65%甲醇、85%甲醇、甲醇、65%乙醇、85%乙醇、甲醇)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，回流提取率較超聲提取高，60 min和120 min提取的樣品含量較高，但差異不大，且甲醇提取效率較高。因此確定樣品制備方法為回流提取60 min，甲醇作為提取溶劑。

3.3 氨試液萃取次數(shù)選擇 分別采用氨試液萃取0、1、 2、3 次，結(jié)果表明，洗滌2次、3次后樣品含量較高，且萃取 2 次與 3 次效果無明顯差異，因此采用氨試液2 次萃取。

綜上所述，本實驗采用高效液相色譜法測定中偏康合劑中黃芪甲苷的含量，方法簡便，精密度高，穩(wěn)定性好，故可作為中偏康合劑質(zhì)量控制的方法之一，為中偏康合劑質(zhì)量標準的進一步完善提供依據(jù)。