基于ITSr DNA高通量測序方法研究玉米粉碎粒度對奶牛瘤胃真菌菌群的影響

吉武龍，郭 成，胡丹丹，張力莉，徐曉鋒

（寧夏大學農學院，寧夏銀川750021）

瘤胃中的微生物是反芻動物進行消化的主要執行者，在反芻動物的消化過程中承擔了非常重要的角色。瘤胃真菌在瘤胃微生物中占8%～20%，在纖維降解的過程中起到了極其重要的作用（Edwards等，2017）。瘤胃真菌能分泌一些高活性的酶，包括纖維素酶、半纖維素酶、木聚糖酶、半乳糖醛酸酶等13種酶（雷威等，2005）。目前從瘤胃中分離得到的真菌共計5個屬十余個種，其有溶解纖維的特性，并且都具有降解植物細胞壁中結構性碳水化合物的能力（于長青等，2004）。瘤胃真菌的數量隨日糧纖維含量的變化而變化：日糧中粗飼料含量較高時，瘤胃中真菌數量也較高；相反，日糧中淀粉或谷物含量較高時，則真菌數量較少（鄧凱東，1998）。瘤胃真菌不僅可以通過纖維素酶來降解纖維素，還可以通過物理方式降解纖維素，主要是從孢子囊中釋放出的游動孢子可游動到易于集聚的植物組織部位，穿透牧草角質層屏障,降解無法被細菌和纖毛蟲降解的木質素纖維物質（于長青等，2004；毛勝勇等，2000；鄧凱東，1998）。瘤胃真菌不僅可以分泌一些纖維素降解酶，而且可以產生α-淀粉酶及淀粉葡萄糖苷酶來降解淀粉（于常青，2004）。粉碎粒度會影響玉米淀粉瘤胃降解速度，本試驗旨在用細粉碎玉米代替占日糧10%干物質的破碎玉米，通過ITSrDNA高通量測序技術研究其對奶牛瘤胃真菌菌群多樣性的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及飼養管理 選用4頭體況良好，泌乳20 d左右，日產奶量大約為30 kg，體重（550±35）kg的經產（二胎）中國荷斯坦奶牛為試驗動物。試驗奶牛采用TMR飼喂方式。

1.2 試驗日糧 根據NRC（2001）奶牛飼養標準配制日糧，日糧組成和營養成分見表1。

1.3 試驗設計 采用2×2交叉試驗設計，對照組奶牛日糧添加10%的破碎玉米。試驗組由細粉碎玉米代替該比例破碎玉米，每個階段試驗期為21 d，預飼期14 d，正試期7 d。

表1 奶牛試驗日糧組成及營養成分

1.4 樣品采集與處理 通過牛口腔導管采集瘤胃液，采集時間分別為飼喂前0 h和飼喂后2、4、6 h，每期連續3 d（16、17、18 d）取樣。為獲得具有代表性的樣品，每天4個時間點所取的瘤胃液樣品經混勻后各取5 mL，充分混合裝入離心管中，放置于-80℃凍存。將3 d樣品混合均勻后取1.5 mL用凍存管保存。

1.5 DNA樣品提取、擴增和Miseq測序 將-80℃凍存的8個瘤胃液樣品4℃溶解，輕微顛倒混勻，靜置5 min，取上清液1 mL轉入1.5 mL離心管中，送往廣州基迪奧生物科技有限公司進行DNA樣品提取、擴增、純化、均一化，制備Miseq文庫、采用Hiseq2500 PE250上機測序。采用1%的瓊脂糖凝膠電泳，在100V恒定電壓下，電泳30 min，采用NanoDrop 2000檢測提取DNA條帶的質量。從樣本中提取基因組DNA后，用帶有barcode的特異引物擴增ITSrDNA的ITS2區。引物 設 計（F：GCATCGATGAAGAACGCAGC；R：ATATGTAGGATGAAGAACGYAGYRAA）。然 后PCR擴增產物切膠回收，用QuantiFluorTM熒光計進行定量。 將純化的擴增產物進行等量混合，連接測序接頭，構建測序文庫，最終利用Hiseq2500 PE250上機測序。

1.6 數據處理與分析 數據經Excel初步整理后，采用SAS 8.2中兩階段交叉設計的方差分析對數據進行分析，采用最小顯著法LSD進行差異顯著性比較，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標準，結果以“平均數±標準誤”表示。

2 結果與分析

2.1 樣品OTU分布 為獲得樣品中物種的多樣性信息，首先對tags進行OTU（Operating Taxonomic Unit）聚類，利用Mothur（v.1.34.0）計算0.03距離下（97%的相似度）的OTU數量。由圖1可以看出，試驗組的OTU為258，對照組的OTU為229，其中兩組共有的OTU為105，試驗組單獨有的OTU為153，對照組單獨擁有的OTU為124，從總體數量來看，試驗組的OTU數量多于對照組，但差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 菌群alpha多樣性分析 Alpha多樣性是對單個樣品中物種多樣性的分析，包括Chao值、Ace值、Shannon指數以及Simpson指數等。Chao值和Ace值兩個多樣性估算指數是根據所測得的tags數和OTU的數量以及相對比例來預測樣品中微生物的種類（OTU的數量）。由表2可知，試驗組的Chao值和Ace值均高于對照組，但兩組的差異不顯著（P＞0.05）。Shannon指數也高于對照組，Simpson指數低于對照組，但差異不顯著（P＞0.05）。試驗結果說明用細粉碎玉米代替破碎玉米（10%DM）并未改變奶牛瘤胃真菌菌群的多樣性與豐富度。

圖1 對照組和試驗組瘤胃中真菌OTUs韋恩圖

表2 樣品多樣性指數

2.3 奶牛瘤胃真菌菌群結構的變化

2.3.1 門水平 如表3所示，從本試驗的奶牛瘤胃內真菌的菌群門水平結構可以看出，試驗組和對照組的子囊菌門、擔子菌門、新麗鞭毛菌門、未培養菌門（Fungi_NA）差異均不顯著（P＞0.05），接合菌門（Zygomycota）的豐度有明顯的上升趨勢（P=0.051），試驗組和對照組在門水平上的差異不顯著，說明用細粉碎玉米代替破碎玉米（10%DM）并未改變奶牛瘤胃真菌菌群門水平上的結構。

表3 奶牛瘤胃真菌門水平%

2.3.2 屬水平 如表4所示，從屬水平的瘤胃液真菌區系物種組成分析，在已知的瘤胃液真菌區系中，德巴利酵母屬（Debaryomyces）、曲霉屬（Aspergillus）、瘤胃壺菌屬（Piromyces）、蠟孢屬（Ceriporia）、酵母菌屬（Saccharomyces）的相對豐度均在5%以上，其中未分類菌屬的相對豐度為19.3%，以上為瘤胃液真菌區系的優勢菌屬。試驗組與對照組相比，德巴利酵母屬的相對豐度降低幅度較大，但組間差異并不顯著（P＞0.05）。試驗組根囊鞭菌屬顯著增加（P＜0.05）。其他優勢菌屬組間差異不明顯（P＞0.05）。念珠菌屬（Candida）、瘤胃 真 菌 屬 （Cae comyces）、NA（Neocallimastigaceae）、新麗鞭毛菌屬（Neocallimastix）、霉菌屬（Mycosphaerella）、青霉屬（Penicillium）、核盤菌屬（Sclerotinia）、根囊鞭菌屬（Orpinomyces）、帚枝霉屬（Sarocladium）等相對豐度為0.5%～5%的菌屬為次優勢菌屬；這些次優勢菌屬在對照組與試驗組組間差異不顯著（P＞0.05）。試驗組其他真菌雖然也有檢出，但是其相對豐度較低，其中柄孢殼屬（Zopfiella）以及被孢霉屬（Mortierella）顯著增加（P＜0.05）。

表4 奶牛瘤胃真菌屬水平%

3 討論

3.1 玉米粉碎粒度對瘤胃液真菌菌群豐度及多樣性的影響 本試驗是基于Hiseq2500 PE250高通量測序平臺對8個樣本的瘤胃液真菌區系的ITS2區進行測序，對瘤胃液真菌區系的多樣性進行定性分析，測序結果可從測序深度和覆蓋度兩個角度進行評估。本試驗8個樣本的優質序列數總和為158120條，平均每個樣本19765條，低于張紅濤（2017）對荷斯坦后備牛的真菌測序深度（5.13萬條），但是高于韓旭峰（2015）對陜北白絨山羊的測序深度（15531條），也高于Kumar（2015）圍產期奶牛瘤胃真菌測序深度（3558條）。同時本試驗的8個樣本的真菌區系測序覆蓋度均超過98.5%，高于張紅濤（2017）對荷斯坦后備牛瘤胃真菌區系測序覆蓋度（98%）。本試驗測序結果基本可以反映出奶牛瘤胃真菌區系中的大部分物種。

瘤胃真菌區系種類與數量受日糧的影響。Boots等（2013）研究發現，飼喂高粗日糧后瘤胃真菌區系的物種豐富度較高。Kumar等（2015）研究表明，產后中等粗料水平（50%粗料）比產前奶牛高粗料水平（80%粗料）的瘤胃真菌區系物種豐富度和多樣性顯著下降。Ishaq等（2017）研究顯示，奶牛因飼喂高谷物飼料，處于亞急性酸中毒時，則會降低瘤胃真菌的菌群豐度和多樣性。通過本試驗可以看出，試驗組與對照組的菌群豐富度指數Chao值和Ace值差異不顯著，菌群多樣性指數Shannon指數與Simpson指數也未呈現顯著差異。說明本試驗條件下，用細粉碎玉米替代破碎玉米（10%DM）并未顯著影響奶牛瘤胃真菌的多樣性與豐富度。

3.2 玉米粉碎粒度對瘤胃液真菌菌群結構的影響 從門水平瘤胃液真菌區系菌群分布可以看出，子囊菌門、新麗鞭毛菌門在試驗組和對照組中均為優勢菌門，與張紅濤（2017）和Liggenstoffer（2010）等研究結果一致。新麗鞭毛菌門廣泛存在于奶牛、羊的瘤胃中，其在纖維的消化過程中發揮著至關重要的作用，主要是通過假根對植物組織的細胞壁進行分解，從而達到分解纖維的目的。本試驗結果顯示，擔子菌門也為優勢菌門，與上面研究結果不同，這可能是因為日糧不同所引起瘤胃真菌菌群的變化。

從屬水平瘤胃液真菌區系菌群分布可以看出，德巴利酵母屬、曲霉屬、瘤胃壺菌屬在已知的屬水平中為優勢菌屬。細粉碎玉米替代破碎玉米之后，奶牛瘤胃德巴利酵母屬的菌群豐度降低達73%，但組間差異并不顯著。Wang（2011）等研究表明，新麗鞭毛菌屬具有纖維降解酶或木聚糖酶活性。因此主要在降解纖維方面發揮作用，細粉碎玉米瘤胃降解速度比破碎玉米快，瘤胃內的pH降低。王照華等（2005）研究表明，精粗比增加瘤胃厭氧真菌數量下降、優勢菌形態發生變化、揮發性脂肪酸濃度增加、pH顯著降低。厭氧真菌發酵葡萄糖、纖維素等碳水化合物后的主要代謝產物為甲酸、乙酸、乳酸、乙醇、CO2及H2（孫美洲，2014）。瘤胃pH降低抑制了德巴利酵母屬的增殖，本試驗結果表明，細粉碎玉米替代破碎玉米之后，奶牛瘤胃德巴利酵母屬的菌群豐度降低達73%，但組間差異并不顯著，說明瘤胃部分真菌區系種類與數量受到個體差異因素的影響。蠟孔菌也呈現與德巴利酵母屬一樣的趨勢，試驗組與對照組比較降低幅度達100%，但組間差異并不顯著，目前關于瘤胃蠟孔屬的研究鮮見報道。孫云章等（2007）研究顯示，隨著日糧精料比例的增加，α-淀粉酶的活性呈上升趨勢，可能是因為精料的含量增加，誘導α-淀粉酶的產生。Dagar（2011）等研究證實，根囊鞭菌屬具有降解淀粉等非結構性碳水化合物酶活性。本試驗結果表明，試驗組相比于對照組，根囊鞭菌屬的菌群豐度顯著升高（P＜0.05）。其他相對豐度較低的真菌，如試驗組柄孢殼屬（Zopfiella）與被孢霉屬 （Mortierella）增加明顯 （P＜0.05），但在瘤胃的功能目前鮮見報道。

4 小結

在本試驗條件下，用細粉碎玉米替代破碎玉米（10%DM）并未顯著影響奶牛瘤胃真菌的多樣性與豐富度。在門水平上，用細粉碎玉米替代破碎玉米對瘤胃真菌影響差異不顯著；在屬水平上，德巴利酵母屬等優勢菌屬有一定程度的下降，而根囊鞭菌屬顯著上升。