兩階段調控優化保加利亞乳桿菌合成γ-氨基丁酸

王紅波，陳國鑫，魏 蜜，劉智杰，陳禪友

（1.江漢大學生命科學學院，湖北省豆類（蔬菜）植物工程技術研究中心，湖北武漢430056；2.湖北工程學院生命科學技術學院，特色果蔬質量安全控制湖北省重點實驗室，湖北孝感432000）

γ-氨基丁酸（GABA）是一種天然存在的非蛋白質氨基酸，具有降血壓、改善腦機能、增強記憶、抗焦慮等生理功能（Kantachote等，2016）。GABA作為飼料添加劑，能夠提高動物抗應激能力，改善胴體品質和提高生產性能（汪祥燕等，2016)。潘雪梅等（2018）研究發現，GABA可以緩解奶牛夏季的熱應激，提高奶牛免疫能力和機體的抗氧化能力。Park等（2015）研究結果表明，GABA作為飼料添加劑能顯著提高蛋雞的生產能力，改善雞蛋品質。常見的生產GABA的益生菌主要有酵母菌和乳酸菌（Kang等，2017）。管軍軍等（2018）認為，乳酸菌是定植在動物腸道中的益生菌，有利于動物的腸道健康，常被用于制備發酵飼料，有助于動物的健康養殖。徐秀景等（2018）研究表明，乳酸菌發酵制備的固態發酵飼料，能夠改善豬肉的品質，提高育肥豬的生長性能。乳酸菌與GABA的聯合生產，能夠顯著改善飼料的營養品質。沈雪嬌等（2018）研究發現，產GABA的短乳桿菌P-14發酵飼料應用于育肥豬的飼養，能提高其生產性能，改善豬肉的品質，提高飼料的報酬率。

保加利亞乳桿菌ATCC 11842是一種在食品加工領域重要的益生菌，在乳制品和功能飲料加工過程中已展現出良好的應用前景（毛雪等，2016）。在飼料加工領域，保加利亞乳桿菌ATCC 11842也具有良好的應用前景。本研究通過探索保加利亞乳桿菌ATCC 11842生物合成GABA的規律，為生產富含GABA的發酵飼料提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 GABA標準品、MRS培養基和谷氨酸鈉均購于北京酷來搏科技有限公司；苯酚、硼酸、硼砂、次氯酸鈉、氫氧化鈉和無水乙醇均購于國藥集團化學試劑有限公司；保加利亞乳桿菌ATCC 11842保藏于江漢大學湖北省豆類（蔬菜）植物工程技術研究中心食品加工實驗室。

1.2 儀器與設備 V-1600紫外可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；TG165型離心機：長沙平凡儀器儀表有限公司；HH-2型水浴鍋：國華電器有限公司；SPX-150B-Z型生化培養箱：上海博迅實業有限公司醫療設備廠。

1.3 方法

1.3.1 菌體培養與GABA生物合成方法 菌體培養方法：保加利亞乳桿菌ATCC 11842活化培養基為MRS固體培養基，培養溫度為30℃；保加利亞乳桿菌ATCC 11842生長培養基為MRS液體培養基，接種量為2%；生長液體培養基置于50 mL離心管，裝液量為48 mL，調整液體培養基pH，控制培養溫度，厭氧靜置培養，培養36 h；每個樣品重復3次。

GABA生物合成方法：在菌體生長液體培養基中添加0.25 g谷氨酸鈉底物，調整液體培養基pH，控制培養溫度，生物轉化48 h；每個樣品重復3次。

1.3.2 菌體生物量測定方法 定時取0.5 mL發酵培養基，6000 r/min離心15 min，棄上清液，用0.5 mL無菌水懸浮菌體，在600 nm條件下測定菌體光密度值（吳軍林等，2018）。在600 nm波長條件下，繪制菌體生物量與光密度的標準曲線，從而計算出培養基中濕菌體的濃度。

1.3.3 GABA樣品制備及其檢測方法 GABA樣品制備：取1 mL發酵液體培養基于1.5 mL離心管，6000 r/min離心10 min，得到的上清液用于GABA含量的檢測。

檢測方法：取0.3 mL上清液于25 mL離心管中；依次加入0.2 mL的0.2 M硼酸鹽緩沖液（pH 9.0），1 mL的6%苯酚溶液，0.8 mL的5%次氯酸鈉溶液，充分振蕩混勻；置于沸水浴中保持10 min；然后迅速置于冰浴中保持15 min；劇烈振蕩至顯示藍色；最后加入2 mL的60%乙醇溶液；在645 nm波長條件下檢測光密度值（Zhang等，2014）。

2 結果與分析

乳酸菌生物轉化谷氨酸鈉生物合成GABA分為兩個階段。第一階段為乳酸菌的生長階段，在此階段需要提供乳酸菌良好生長環境，使乳酸菌達到最大的生物量；第二階段是GABA的生物合成階段，在此階段需要控制谷氨酸脫羧酶良好的活性環境，谷氨酸鈉在谷氨酸脫羧酶的催化作用下生物合成GABA（Ttt等，2014）。Shi等（2017）研究表明用短乳桿菌靜息細胞生物轉化谷氨酸生成GABA有兩個關鍵的控制因素，一是pH控制在4.5，二是溫度控制在45℃。Peng等（2013）研究結果也表明分步控制溫度和pH條件，用短乳桿菌CGMCC 1306生物轉化谷氨酸能獲得良好的轉化效率。因此，本研究探索分兩階段分別控制菌株的生長和GABA的生物合成，以期提高GABA的產量。

2.1 pH和溫度對菌株生長的影響 由圖1可知，pH能顯著影響保加利亞乳桿菌ATCC 11842的生長。在菌株生長36 h時，pH為5、6、7、8、9時的菌體生物量分別為11.60、17.10、15.58、13.93、9.48 g/L。pH高于9時，菌株的生長受到顯著抑制。pH為6時菌株的生長最佳。終產物乳酸的積累是抑制乳酸菌生長的重要原因，調節培養基初始pH會影響乳酸菌生長。閆征等（2003）研究表明，調節培養基初始pH，乳酸菌在pH 6和pH 6.5條件下，表現出較好的生長。楊靜等（2017）的研究結果也表明，乳酸菌生長的最適pH為5.5～7.0。

由圖2可知，溫度能顯著影響保加利亞乳桿菌ATCC 11842的生長。在菌株生長36 h時，溫度為25、30、35、40、45℃時的菌體生物量分別為13.60、15.44、16.90、15.62、5.40 g/L。溫度高于45℃，菌株生長受到明顯抑制。其中35℃是菌株生長的最佳溫度。王奎明（2007）研究結果表明，保加利亞乳桿菌在MRS培養基中和37℃條件下生長良好。培養基組分也會影響保加利亞乳桿菌的最適培養溫度。曾少葵等（2017）以牡蠣酶解液為原料，保加利亞乳桿菌的最適生長溫度為40℃。

圖1 不同pH條件下菌體生長曲線

2.2 pH和溫度對GABA生物合成的影響 pH和溫度會影響酶分子的活性結構以及酶分子與底物的結合（周文斯等，2018；陳穩等，2018）。調控反應的溫度和pH對谷氨酸脫羧酶活性有重要影響，進而影響GABA的生物合成（Wu等，2018；時粲等，2016）。

保加利亞乳桿菌ATCC 11842在MRS液體培養基中生長36 h時，培養基pH降為6.0，當添加0.25 g谷氨酸鈉后，培養基pH變為4.5。在此基礎上調整發酵液的pH分別至5、6、7、8、9，溫度為35℃，生物轉化48 h后，比較GABA的產量。由圖3可知，pH能顯著影響GABA的產量。在pH為5、6、7、8、9五個不同條件下GABA產量分別為3.25、3.30、3.75、5.0、3.71 g/L。其中pH為8時GABA生物合成量最高。隨著菌株的生長，菌株產酸也會使發酵液的pH降低。孟丹等（2017）研究表明，乳酸乳球菌乳亞種HUCM 201生物合成GABA最佳初始pH為6.5，其發酵液中γ-氨基丁酸的質量濃度為0.22 g/L。曾林等（2017）從四川泡菜中分離出一株具有產GABA能力的植物乳桿菌BC114，并對其發酵條件進行優化，結果表明，其最佳pH為5.50，GABA產量為3.82 g/L。

圖2 不同溫度條件下菌體生長曲線

圖3 不同p H條件下GABA產量

由圖4可知，溫度能顯著影響GABA的產量。在溫度為25、30、35、40、45℃條件下的GABA產量分別為2.57、2.69、3.33、4.77、3.96 g/L。其中40℃是GABA生物合成的最佳溫度。韓昱姝等（2017）從泡菜中篩選出一株短乳桿菌LF-fb-017，其GABA產量可達1.68 g/L，其最佳生物轉化溫度為37℃。Park等（2014）研究結果也表明，乳酸菌來源的谷氨酸脫羧酶最佳活性溫度為41℃。

2.3 優化前后GABA產量的比較 參照前期研究方法，保加利亞乳桿菌ATCC 11842在MRS培養基中生物轉化谷氨酸鈉合成GABA，在自然pH和恒溫30℃條件下，GABA產量為2.36 g/L（Wang等，2019）。用兩階段調控生物合成GABA的方法，菌株在初始pH 6.0，溫度35℃條件下生長36 h，再調整發酵液pH至8.0，溫度調整至40℃，生物轉化48 h，GABA的產量達到5.98 g/L，如圖5。優化后GABA的產量較優化前GABA的產量提高了153.39%。張竺英等（2014）從豆豉中篩選的產γ-氨基丁酸的乳酸菌HY15，該菌株在含1%（W/W）谷氨酸鈉的MRS發酵培養基中，37℃厭氧培養48 h后，發酵液中GABA產量達到0.161 g/L。史曉萌等（2017）從哈薩克族傳統發酵食品中篩選出一株乳酸乳球菌KCH1，GABA產量達329.81 mg/L。吳非等（2012）利用紫外線對GABA高產菌株保加利亞乳桿菌L2進行誘變處理，獲得高產GABA突變菌株L2-4，其在含有1%L-谷氨酸改良MRS培養基中的GABA產量達到4.235 g/L。因此，保加利亞乳桿菌ATCC 11842 GABA的合成能力顯著高于上述報道的乳酸菌株。

圖4 不同溫度條件下GABA產量

圖5 優化前后GABA產量對比

3 結論

本試驗結果表明，對菌株生長和GABA生物合成的pH和溫度進行兩階段分開控制，能顯著提高GABA的產量。菌株在初始pH 6.0，溫度35℃條件下生長36 h后，再調整發酵液pH至8.0，溫度40℃，GABA的產量達到5.98 g/L。優化后GABA的產量較優化前GABA的產量提高153.39%。