菊芋全粉對刺參生長性能及燦爛弧菌刺激下免疫因子應答變化的影響

賈晨晨，包煥玲，孟現堯，朱曉振，衣悅濤

（1.中國科學院煙臺海岸帶研究所，山東煙臺264003；2.中國科學院大學，北京100049；3.山東東方海洋科技股份有限公司，山東煙臺264003）

近年來，我國刺參養殖產業迅速發展。2017年我國刺參總產量達25萬噸，是海水養殖業的支柱型產業（姜森顥等，2017）。但由于刺參缺乏特異性免疫，細菌性疾病對刺參危害極大。燦爛弧菌作為一種致病性嗜鹽細菌（馬愛敏等，2009），是引發刺參腐皮綜合征的主要致病菌。刺參感染燦爛弧菌后會造成極高的死亡率，制約了刺參養殖業的健康發展（王印庚等，2004）。

為提高刺參抗病力，除了微生態制劑、中草藥成分添加劑改善刺參免疫能力外，利用益生元改善刺參腸道健康也是一種前景良好的新策略（趙倩等，2017；柳序等，2016）。研究證明，益生元能夠提高水產動物對營養的利用率，增強新陳代謝，并促進水產動物生長性能，增強其抗病能力（Guer reiro等，2017；Yang等，2016；Torrecillas等，2011），這些研究為益生元在水產養殖中的應用奠定了研究基礎。

菊芋全粉微溶于水，制備成本低，其中含50%～60%的菊粉，菊粉作為水溶性益生元，具有調節腸道微生物組成、增強免疫和提高抗病能力等功能。因菊粉使用成本高，水溶性強，因此本試驗選用菊芋全粉作為益生元飼料添加劑應用于刺參養殖中，研究其對刺參生長性能、燦爛弧菌刺激下刺參體腔液中相關免疫酶應答變化的影響，以期為菊芋全粉在刺參養殖中的應用及刺參的健康養殖提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 試驗所用刺參由山東東方海洋科技股份有限公司養殖場提供，初始體重為（4.7±0.1）g，將刺參飼養于40 L塑料質水箱中，水溫（17±1）℃，pH（8.1±0.2），海水鹽度為27‰～29‰，每日投喂1次（16：00）飼料，投喂量為刺參體重的3%，每日采用虹吸法去除殘餌及糞便并換水30%。暫養1周后用于試驗。

1.2 試驗設計 暫養結束后，挑選360只健康刺參，隨機分為3組，每組6個平行，每個平行20只刺參，對照組飼喂基礎日糧，試驗Ⅰ、Ⅱ組分別在基礎飼料中添加5 g/kg和15 g/kg菊芋全粉，飼養周期為28 d。日糧組成及營養水平如表1所示。

表1 試驗日糧組成及營養水平

1.3 燦爛弧菌感染試驗 28 d養殖試驗結束后進行感染試驗，試驗使用的燦爛弧菌經活化后接種于2216E培養液中（梁超，2011），在30℃下培養24 h，調整菌液濃度為109cell/mL，用1 mL無菌注射器經腹腔注射對刺參進行感染，每只注射量為0.1 mL。繼續投喂飼料。

1.4 測定指標與方法

1.4.1 生長性能指數測定及分析 試驗前將各組刺參稱重并計算平均初重W0，分別在飼養試驗第28天時，將各組刺參禁食24 h后，稱重Wt，日增重（ADG）和飼料利用率（FCR）計算公式如下：

式中：t為飼養試驗天數，d；F為刺參總攝食量，g。

1.4.2 免疫因子活力變化的測定 在感染試驗后第0、1、2、3、4、5天時分別從每組取出9只健康刺參，在冰盤上取出刺參體腔液，于4℃、3000 r/min離心10 min，取上清液于離心管中，置于-80℃冰箱中保存，用作體腔液免疫指標的測定。

刺參體腔液樣品中酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）、溶菌酶（LZM）和超氧化物歧化酶（SOD）活性采用試劑盒（南京建成公司）測定。

1.5 數據處理與分析 數據用SPSS 16.0軟件進行單因素方差分析（One-way ANOVA），結果以“平均值±標準差”表示，當P＜0.05時為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 菊芋全粉對刺參生長性能的影響 由表2可知，與對照組相比，試驗Ⅰ、Ⅱ組刺參的平均日增重和平均日攝食量差異不顯著（P＞0.05）；試驗Ⅱ組刺參的飼料利用率顯著高于對照組（P＜0.05）。說明15 g/kg菊芋全粉能顯著提高刺參的飼料利用率。

2.2 菊芋全粉對燦爛弧菌刺激后刺參免疫因子應答變化的影響

2.2.1 燦爛弧菌刺激后刺參ACP活力變化 測定結果顯示，燦爛弧菌刺激后，刺參的ACP活性呈先增加后降低的周期性變化，試驗Ⅰ組刺參ACP活力在第3天顯著高于對照組，而在第2、第4天卻顯著低于對照組（P＜0.05）；試驗Ⅱ組刺參的ACP活力在第3天時顯著高于對照組（P＜0.05），其他時間與對照組無顯著差異（圖1）。

表2 菊芋全粉對刺參生長性能的影響

圖1 燦爛弧菌刺激后刺參體腔液中ACP活力變化

2.2.2 燦爛弧菌刺激后刺參AKP活力變化 由圖2可知，燦爛弧菌刺激后刺參AKP活力急劇增加，但隨著時間的延長AKP系統的應答能力逐漸恢復到初始水平。這可能是由于AKP完成了對入侵燦爛弧菌的免疫應答。此外，試驗Ⅱ組刺參AKP活力始終顯著高于對照組（P＜0.05），結果表明在燦爛弧菌感染時，添加15 g/kg菊芋全粉可以顯著提高刺參AKP活力。

2.2.3 燦爛弧菌刺激后刺參SOD活力變化 由圖3可知，相較于對照組，試驗Ⅰ組刺參在細菌感染1 d后SOD活力顯著提高（P＜0.05），之后下降并逐漸趨于初始水平；試驗Ⅱ組刺參在細菌感染第1天和第2天時SOD活力始終顯著高于對照組（P＜0.05），并從第3天開始逐漸下降至初始水平。結果表明在燦爛弧菌刺激下，15 g/kg菊芋全粉對SOD活力的提高作用更為明顯。

2.2.4 燦爛弧菌刺激后刺參LYZ活力變化 如圖4所示，燦爛弧菌刺激后第1、2天，試驗Ⅱ組與對照組刺參LYZ活力受到抑制，而試驗Ⅰ組刺參LYZ活力顯著升高（P＜0.05），并在第4天時恢復到初始水平。結果表明燦爛弧菌會抑制刺參的溶菌應答反應，飼料中添加5 g/kg菊芋全粉可顯著改善這種抑制。

3 討論

3.1 菊芋全粉對刺參生長性能的影響 關于益生元對水產動物生長性能的影響報道不一，有研究認為并無顯著效果，也有研究證明益生元可改善水產動物的生長性能（Guerreiro等，2015；孫永欣等，2012；Ringo等，2010），這可能與益生元的種類、添加量及水產動物的種類、年齡、養殖方式等均有關系。本研究采用菊芋全粉作為益生元飼料添加劑，試驗結果表明，飼料中添加15 g/kg菊芋全粉可顯著提高刺參的飼料利用率，其原因可能是菊芋全粉會影響刺參腸道結構或者消化酶活性，進而促進刺參的生長，提高其對飼料中營養物質的利用率，這與Abdelmalek等（2015）對海鱸魚的研究結果一致。本研究中菊芋全粉對刺參的ADG影響不大，可能是試驗周期短，其中機理仍需進一步研究。

3.2 菊芋全粉對燦爛弧菌刺激后刺參免疫因子應答變化的影響 燦爛弧菌作為刺參腐皮病的主要病原菌，制約著刺參養殖業的健康發展。益生元作為功能性成分，可以改善水產動物腸道健康，進而增強機體免疫力。因此本研究將菊芋全粉作為益生元飼料添加劑應用于刺參飼料中，研究其對燦爛弧菌刺激后刺參體腔液內免疫因子如ACP、AKP、SOD及LYZ活力變化的影響。其中ACP是巨噬細胞溶酶體的標志酶，可吞噬消化顆粒形異物（Meng等，2003）。本研究結果顯示燦爛弧菌感染時，ACP可有效應答弧菌入侵，其活力呈現先增加后降低的周期性變化，這可能是由于ACP大量參與對弧菌的反應，使得ACP活力提高，隨后由于ACP大量消耗造成ACP活力暫時性下降，研究結果表明，15 g/kg菊芋全粉可抑制ACP活力降低的程度。AKP是一種對底物專一性要求較低的磷酸單脂水解酶，是重要的解毒系統，并與一些營養物質的消化吸收有關（Zhang等，2000）。研究結果表明，15 g/kg菊芋全粉可顯著提高細菌感染時刺參AKP活力，劉云等（2008）用海藻硫酸多糖與殼聚糖喂養刺參，也得到了類似結果。SOD作為一種重要的抗氧化酶，主要參與清除體內過量的自由基，同時在機體清除病原菌過程中增強自我防御功能，因此SOD活力是反映機體免疫力的重要指標（董曉亮等，2013），本研究結果表明燦爛弧菌刺激后，刺參SOD活力呈現先升高后逐漸恢復至初始水平的趨勢，其中菊芋全粉添加量為15 g/kg時效果最佳，該結果與貽貝（Mytilus edulis）（Tanguy等，2013）的結果不同，燦爛弧菌并沒有抑制SOD系統的應答能力，這可能與動物種類、年齡有關。LYZ通過水解革蘭氏陽性菌細胞壁中的乙酰氨基多糖，可破壞和消除入侵異物，從而起到殺菌防御功能（王淑嫻等，2010）。研究結果表明，燦爛弧菌入侵初期，對照組刺參LYZ活力受到抑制，這與叢聰（2015）的研究結果一致，但5 g/kg菊芋全粉組刺參LYZ活力卻顯著增強，這表明5 g/kg菊芋全粉在燦爛弧菌感染初期可顯著提高LYZ活力。

圖2 燦爛弧菌刺激后刺參體腔液中AKP活力變化

圖3 燦爛弧菌刺激后刺參體腔液中SOD活力變化

圖4 燦爛弧菌刺激后刺參體腔液中LYZ活力變化

4 結論

日糧中添加15 g/kg菊芋全粉可顯著提高刺參的飼料利用率；燦爛弧菌刺激時能有效地提高刺參體液中ACP、AKP、SOD活力，而5 g/kg菊芋全粉可顯著提高燦爛弧菌誘導時刺參LYZ活力；綜上，本試驗條件下菊芋全粉的添加量為15 g/kg時，刺參的免疫因子活力提高效果顯著，因此菊芋全粉具備作為刺參免疫增強劑的潛在應用價值。