蠲痹湯治療類風濕關節炎的網絡藥理學分析

應 敏 ，王 穎 ，劉金坤

（1.重慶大學附屬腫瘤醫院·重慶市腫瘤研究所·重慶市腫瘤醫院，重慶 400030； 2.重慶市中醫院·中醫藥基礎研究室，重慶 400021； 3.成都中醫藥大學藥學院，四川 成都 611137）

類風濕關節炎（RA）是以侵蝕性關節炎為主要臨床表現的自身免疫性疾病，可發生于任何年齡[1]。以往的研究認為，促炎細胞因子和抗炎細胞因子的失衡促進自身免疫、炎癥和關節破壞是RA的主要誘因，其基本病理表現為滑膜炎、血管翳形成，并逐漸出現關節軟骨和骨破壞，最終導致關節畸形和功能喪失[2]，可并發肺部疾病、心血管疾病、惡性腫瘤及抑郁癥等[3]。RA屬中醫學“痹證”范疇。蠲痹湯出自清代程國彭《醫學心悟》，“通治風、寒、濕三氣，合而成痹”，本方具有祛風、除濕、散寒、活血、通絡、止痛之功效，是臨床治療風寒濕痹的常用方劑。方中羌活、獨活、桂枝、秦艽、海風藤祛風、除濕、散寒，輔以當歸、川芎、乳香、木香、桑枝、甘草理氣活血、養血通絡，全方溫而不燥烈，通而不傷正。近年來，以蠲痹湯為基本方隨證加減，已擴展到臨床多種疾病的治療，并獲得滿意效果[4]。網絡藥理學是建立在疾病-靶點-藥物的多層次網絡基礎上，用于從整體上預測藥物靶點、提高藥物發現效率[5]，并逐漸在中藥研究中得到廣泛應用。本研究中采用網絡藥理學技術研究了蠲痹湯治療RA的物質基礎和作用機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 蠲痹湯的化學成分

依托中藥系統藥理學分析平臺（TCMSP，http：／／lsp.nwu.edu.cn ／tcmsp.php）[6]檢索蠲痹湯全方羌活、獨活、桂枝、秦艽、海風藤、桑枝、當歸、川芎、乳香、木香、甘草的所有化學成分，共搜集1 412個化合物，其中羌活185個，獨活99個，桂枝220個，秦艽27個，海風藤31個，桑枝23個，當歸125個，川芎189個，乳香127個，木香106個，甘草280個。

1.2 口服生物利用度（OB）和類藥性（DL）篩選

蠲痹湯處方藥材的化合物OB和DL篩選閾值分別為 OB≥30% ，DL≥0.18。通過篩選，1 412 個化合物分子中有146個符合條件，并將其作為候選化合物。

1.3 化合物-靶點網絡和靶點-疾病網絡的構建

通 過 檢 索 GeneCard 數 據 庫 （https：／／www.genecards.org／）[7]，發現 RA 靶點 3 653 個，根據評分排名前5的靶點分別是白細胞介素6(IL-6)、人類白細胞抗原組織相容復合物DRβ1(HLA-DRβ1)、腫瘤壞死因子(TNF)、蛋白酪氨酸磷酸酶非受體型22(PTPN22)、IL-10。將蠲痹湯的處方藥材、化合物、靶點和RA通過Cytoscape 3.7.1 軟件（http： ／／www.cytoscape.org／）[8]構建處方-活性化合物-靶點-疾病網絡，以探究蠲痹湯治療RA的藥理學作用機制。

1.4 蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡的構建

為了說明靶點蛋白在系統水平上的作用，將蠲痹湯相關靶點基因上傳至 String 11.0數據庫（http：／／string-db.org）[9]，本研究中選取的是評分值高于 0.9最高置信度的數據，構建由導入基因所表達。

1.5 基因本體（GO）功能富集京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析

為了說明中藥化合物的靶點蛋白在基因功能和信號通路中的作用，本研究中采用Rversion 3.5.2軟件（https： ／／www.r-project.org／） clusterProfiler富集分析包[10]對蛋白質進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。同時，采用 Metascape 數據庫（http：／／metascape.org ／）[11]進行在線分析。

2 結果

2.1 活性化合物的篩選

為了提供更準確的結果，本研究中挑選TCMSP平臺中OB和DL都較高的化合物，以及已有文獻報道的活性化合物進行分析，共篩選出活性化合物146個。

2.2 蠲痹湯化合物-靶點-疾病相互作用網絡

利用11味藥材、146個化合物與213個靶點，其中包括與RA共有的148個靶點構建處方-化合物-靶點-疾病。在互作網絡中，包括371個節點（11味藥材，146個化合物節點和213個靶點，1個疾病節點）和1 909條邊，詳見圖 1。其中，1個節點的度（Degree）表示網絡中和節點相連的路線條數。根據網絡的拓撲學性質篩選Degree較大的節點進行分析，這些連接化合物或靶點較多的節點在整個網絡中起樞紐作用，可能是關鍵的化合物或靶點。部分處方-化合物-靶點-疾病的關系見表1。網絡中，蠲痹湯中存在1個化合物與多個靶點之間的相互作用，同時也存在不同化合物共同作用于同一個靶點的現象，這體現了蠲痹湯多成分與多靶點之間共同作用的機制，同時也符合中藥復方的特點。提取蠲痹湯與RA的共有作用靶點，分析藥材成分與靶點間的關系。從化合物的角度，有4個化合物的作用靶點≥30個，MOL000098（quercetin， 槲 皮 素 ）、 MOL000358（betasitosterol，β -谷 甾 醇 ）、MOL000422（kaempferol，山 柰酚）、MOL000449（stigmasterol，豆固醇），分別對應 104，85，72，30個靶點蛋白。對于靶點蛋白，Degree≥ 50個的有 8個，分別為雌激素受體 1（estrogen receptor 1，ESR1，88 個）、ESR2（53 個）、細胞周期蛋白（cyclin A2，CCNA2，55 個）、糖原合成酶激酶（glycogen synthase kinase-3 beta，GSK3B，57 個）、一氧化氮合成酶 2（nitric oxide synthase 2，NOS2，67 個）、雄激素受體（androgen receptor，AR，71 個）、前列腺素 G ／H 合酶 1（prostaglandin G ／H synthase 1，PTGS1，71 個）、PTGS2（133 個）。

表1 處方藥材-化合物-靶點-疾病的關系

圖1 處方中藥材-成分-靶點-疾病互作網絡圖

2.3 蠲痹湯靶點PPI網絡的構建與分析

為了更好地理解蠲痹湯的作用機制，基于PPI關系，利用String軟件構建了蠲痹湯靶點的PPI網絡（見圖2）。PPI網絡包含213個蛋白質節點，870條相互作用關系（連線）平均節點度為 8.17，局部聚類系數為0.467。Degree≥ 20 的節點包括 ESR1（20 個）、維甲酸受體 -α（retinoic acid receptor-alpha，RXRA，20 個）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor A，VEGFA，20個）、絲分裂原激活蛋白激酶8（mitogen-activated protein kinase 8，MAPK 8，21 個）、IL-6（23 個）、轉錄因子 p65（transcription factor p65，RELA，26 個）、轉錄因子 AP（transcription factor AP-1，JUN，28 個）、TNF（31 個）、絲氨酸 ／蘇氨酸蛋白激酶 1（alpha serine ／threonine-protein kinase，AKT1，36 個）。其中，IL-6 和 TNF在RA的疾病靶點中起著重要作用。

2.4 GO富集與KEGG通路富集分析

采用ClusterProfiler包富集分析功能，對蠲痹湯PPI網絡中涉及的213個蛋白質的功能進行了研究。在PATHWAY富集分析中，確定了141個通路（P＜0.001，圖3 A根據 P值列出前15個），本研究中與RA相關的通路有糖基化終末產物（advanced glycation end products，AGE）-糖基化終末產物受體（receptor for advanced glycation end products，RAGE）、IL-17、TNF、輔助 T 細胞17（helper T-cells 17，Th17）細胞分化、MAPK 細胞信號通路等（見表 2），分別有 35，27，28，24，33 個基因富集在以上信號通路中。GO功能分析中生物過程相關的條目1 685個，涉及脂多糖代謝、氧化應激、類固醇代謝、血液循環、對腫瘤壞死因子的調控等方面；細胞組成相關的條目62個，涉及細胞膜、轉錄因子復合物、神經突觸、網格蛋白包被的囊泡、血小板等方面；分子功能相關的條目129個，涉及調控轉錄因子活性，類固醇激素受體、G蛋白偶聯胺受體、腎上腺素受體、血紅素結合、神經遞質受體、乙酰膽堿受體、G蛋白偶聯神經遞質受體活性、TNF受體超家族結合等方面（見圖3），Metascape數據庫分析靶點富集通路和功能得到類似結果（見圖4），表明蠲痹湯通過以上生物過程，調控細胞組成，從而發揮相關的分子功能。

表2 蠲痹湯中與類RA的相關通路及基因

圖2 蠲痹湯靶點蛋白之間的互作關系分析

3 討論

蠲痹湯可祛風除濕、蠲痹止痛，主治風寒濕三氣合而成痹者，具有益氣活血之功效，氣通則血活，血活則風散。由于方中成分眾多，需要整體、系統地對其機制進行分析，采用網絡藥理學技術是比較合適的研究途徑。

TCMSP數據庫的數據主要來源于DrugBank數據庫，具有較高的可信度[6]。化合物-靶點網絡顯示蠲痹湯中含有的眾多成分及成分相關的靶點，揭示了復方中藥多成分、多靶點的內涵。蠲痹湯篩選后的活性成分包括146個化合物，可在體內作用于213個靶點，其中包括與RA共有的148個靶點（占69.48%）。進一步分析發現，蠲痹湯的活性成分中含有較多的黃酮類和皂苷類化合物。方中桂枝、桑枝、甘草總黃酮、川芎總皂苷、羌活總皂苷、獨活總皂苷等均對RA有較好的防治作用[12]，參與調控 IL-6，TNF，IL-10，IL-1β，轉 化 生 長 因 子 β1（transforming growth factor beta-1，TGF- β1）、C 反應蛋白（c-reactive protein，CRP）、基質金屬蛋白酶 3（matrix metallopeptidase 3，MMP3）、趨化因子 2（chemokine receptortype2，CCL2）、γ 干擾素（interferon gamma，IFN-γ）、MMP1、白細胞介素 8（interleukin-8，CXCL8），IL-1α等靶點。黃酮類化合物具有明顯清除人體內自由基、抗老化、抗炎、抗突變等功能，所含槲皮素、谷甾醇和山柰酚具有抗氧化、抗癌和抗誘變活性作用[13]。另外，羌活、獨活、當歸、川芎中的 7-羥基香豆素（7-hydroxycoumarin）、5，7- 二 甲 氧 基 香 豆 素 （5，7-dimethoxycoumarin）、 紫 花 前 胡 內 酯 （nodakenetin）、 阿 魏 酸（ferulicacid）、異歐前胡素（isoimperatorin）等揮發油、香豆素、酚酸類及倍半萜類等物質群作用于內源性過氧化物合酶PTGS1及PTGS2，轉錄因子JUN及STAT1等靶點，提示黃酮類、皂苷類、揮發油類、香豆素類、酚酸類及倍半萜類成分可能是蠲痹湯治療RA的有效物質群。

圖3 KEGG通路富集和GO功能分析

目前認為，RA的發病機制發生與免疫紊亂、遺傳易感因素和環境因素等多因素共同影響有關，尤其與免疫方面關系最為密切，細胞因子、Th1／Th2細胞平衡、細胞凋亡、激素調節、原癌基因等在RA的發病過程中起著重要作用[14]。在KEGG信號通路中，發現AGERAGE信號通路中的RAGE受體是晚期糖基化終產物（RAGE）的多配體受體[15]。RAGE在許多免疫細胞上表達，包括中性粒細胞，單核細胞／巨噬細胞，淋巴細胞和樹突細胞[16]。RAGE在各種疾病（RA、炎性腎病、動脈硬化）的炎性病變中上調，具有結合促炎配體的能力，阻斷RAGE會阻止中樞炎癥信號傳導，導致炎性反應的延遲[17]，表明RAGE是免疫／炎性反應的重要參與者。

生物制劑用于阻斷細胞因子如 TNF-α，IL-1，IL-6在治療RA中的作用已被臨床證實。TNF具有引發或直接介導白細胞活化、黏附和遷移、內皮活化和血管生成、趨化因子表達、基質細胞活化、軟骨細胞活化、激活破骨細胞的作用。特異性阻斷TNF的臨床研究表明，TNF還介導其他作用：如在中樞神經系統中，改變認知，抑郁和疲勞；在代謝中，通過改變的膽固醇抑制和胰島素受體抗性；在脈管系統中，可直接調節內皮功能障礙。在局部滑膜環境中，IL-6介導的作用與TNF相似，具有直接驅動急性期反應的附加作用。與TNF相比，IL-6似乎也提供了與脂質代謝更廣泛的整合。IL-6具有免疫調節作用，在早期T細胞分化為促炎性Th17細胞或調節性T細胞（TREG）的通路中起檢查點作用。在血清陽性 RA 中，IL-17，IL-6，STAT3，NF-κB 的失調與自身免疫疾病產生密切相關[18]。

IL-17針對細胞外細菌和真菌感染的會引發保護作用，但當過量產生時，其會導致與許多炎癥和自身免疫疾病相關的慢性炎癥。IL-1和TNF-α通過滑膜成纖維細胞驅動MMPs的產生，進一步促進炎癥并促進關節軟骨的侵襲，而IL-1和IL-17將軟骨細胞轉化為降解的表型，從而導致軟骨破壞[19-20]。類似的，TNF-α和IL-17誘導破骨細胞早期分化所需的M-CSF的產生，并且與 IL-1，IL-6和前列腺素 E2（PGE2）一起上調核因子的受體活化劑[21-23]。

圖4 Metascape數據庫分析靶點富集通路和功能

Th17細胞是一種能分泌IL-17的T細胞亞群，在自身免疫性疾病和機體防御反應中具有重要意義。TGF-β，IL-6，IL-23，IL-21 在 Th17細胞的分化形成過程中起著積極的促進作用，而IFN-γ、IL-4、細胞因子信號傳送阻抑蛋白3（Socs3）和IL-2則抑制它的分化[24]。MAPK在這些促炎細胞因子的產生和導致關節炎癥和破壞的下游信號傳導事件中起關鍵調節作用。MAPK信號通路中ERK，JNK，p38 MAPK 3類活化形式在RA患者滑膜組織中顯示出不同的定位模式。磷酸化的p38MAPK在滑膜微血管的內皮和滑膜襯里層的細胞中均表達。相比之下，在滑膜微血管周圍滑膜襯里區域內的單核浸潤細胞中檢測到ERK MAPK的激活，而JNK MAPK主要在下襯區域的單核浸潤細胞中顯示出活性[22]。TNF-α，IL-1，IL-6 通過誘導滑膜中存在的許多細胞產生 IL-8，MMP和黏附分子，在促進 RA發生中起重要作用，從而進一步增強細胞浸潤、炎癥和軟骨破壞。此外，TNF-α和IL-1在炎癥滑膜組織p38和ERK MAPK的活化中發揮重要的體內作用，因TNF-α或 IL-1阻斷降低了TNF-α滑膜中這些MAPK的活化[25]。

綜上所述，蠲痹湯中的黃酮類、皂苷類、揮發油、香豆素類等通過抑制炎癥及自身免疫疾病相關的TNF，IL-6，IL-17，Th17，PTGS2，JUN 等眾多靶點，進而抑制AGE-RAGE，IL-17，TNF，Th17 細胞分化、MAPK 等與炎性反應、自身免疫相關的信號通路，從而發揮治療作用。目前的網絡藥理學研究雖在中藥復方作用機制方面取得了不俗成就，但也存在一些問題需要克服，如復方中藥劑量與藥理作用之間的關系，提取濃縮過程中藥物成分變化，藥物成分之間的相互作用對藥效的影響都是需要解決的問題，還有待進一步深入研究。