杜仲治療骨質疏松的網絡藥理學作用機制探討

董航， 嚴嬌， 謝銥子， 紀樹亮， 孫偉鵬， 孫治中， 李宗瑤

（1.廣州中醫藥大學第一附屬醫院三骨科，廣東廣州 510405；2.廣州中醫藥大學第一臨床醫學院，廣東廣州 510405）

骨質疏松（osteoporosis，OP）好發于中老年人，是由多種因素導致的一種全身骨代謝性疾病。骨質疏松患者骨脆性增加，主要臨床癥狀為疼痛、身長縮短、駝背等。其最嚴重的并發癥是骨折，給患者帶來了沉重的經濟負擔和身心的雙重痛苦[1]。有關資料顯示，骨質疏松的發病率已高居世界各種常見疾病中的第7位。隨著我國逐漸步入人口老齡化社會，骨質疏松的治療日漸受到重視[2]。然而，許多臨床研究結果表明，臨床上常用的抗骨質增生西藥均具有一定的不良反應，如長期使用激素治療的患者，其罹患乳腺癌、子宮內膜癌、冠心病等疾病的幾率將有不同程度的升高[3，4]。骨質疏松的臨床癥狀與中醫疾病“骨痿”、“骨痹”、“骨枯”中的“不通則痛”、“腰脊不舉”、“兩足軟弱”、“不任其身”等表現相符。中醫以“骨痿”、“骨痹”或“骨枯”論治骨質疏松，重溫補腎陽、強筋壯骨，兼以通經活絡、祛風除濕、補氣養血[5]。其注重整體調理，且毒副作用小、簡便廉驗的優勢，得到越來越多醫生和患者的認可，逐漸受到了關注[6，7]。

杜仲為杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoides Oliv.的干燥樹皮。其味甘，性溫，歸肝、腎經，具有補肝腎、強筋骨、安胎的功效，主治腎虛腰痛、足膝痿弱。《神農本草經》言其“主腰脊痛，補中，益精氣，堅筋骨”。有研究發現，杜仲能夠顯著提高大鼠血清鈣和雌二醇水平，同時降低骨鈣素及堿性磷酸酶的含量，從而治療大鼠去卵巢后引起的骨質疏松，且鹽制杜仲的療效優于生杜仲[8]。另外，杜仲的有效成分還具有減慢大鼠去勢引起的骨質量下降及骨小梁減少，促進骨鈣素、骨保護素mRNA和護骨素蛋白表達的作用[9-11]。臨床研究表明，杜仲及其中成藥能顯著降低骨質疏松患者血清腫瘤壞死因子α（TNF-α）、I型前膠原N端前肽（PINP）、轉化生長因子β（TGF-β）水平，上調血清血管內皮生長因子（VEGF）水平，改善骨質疏松患者的骨代謝與骨密度情況[12，13]。當前對杜仲治療骨質疏松作用機制的研究主要為動物實驗和臨床實驗，但仍不能整體、全面地反映杜仲作用機制網絡。

網絡藥理學是基于系統生物學的理論，對生物系統的網絡分析，選取特定信息節點進行多靶點藥物分子設計的新學科。其融合系統生物學、多向藥理學、生物信息學、計算機科學等多學科的技術和內容，進行“疾病表型——基因——靶點——藥物”等多層次網絡的構建，探索藥物與疾病間的關聯性，指導新藥研發，闡明藥物作用機理。

杜仲治療骨質疏松是多組分、多環節、多靶點綜合作用的結果，針對單一靶點進行研究，難免存在局限性。網絡藥理學整體性、系統性及復雜性的研究角度和研究方法，正與中醫藥特點相符合。遵循傳統中醫藥理論，應用多種現代醫學先進的理論和技術手段，深入探討杜仲防治骨質疏松的機理，從整體上闡明其改善機體的調節作用機制，是中藥現代化發展的需要。因此，本研究采用網絡藥理學方法從整體角度對杜仲治療骨質增生的作用機制進行探討，以期為深入研究杜仲及含有杜仲的中藥復方的抗骨質疏松作用和臨床應用提供參考依據，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1藥物活性成分的獲取通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）（http：//lsp.nwu.edu.cn/，Version 2.3），以“杜仲”作為關鍵詞進行檢索，設置限定條件為口服利用度（OB）＞30%，類藥性（DL）＞0.18，獲取杜仲同時符合上述兩個條件的所有化學成分信息。利用Pubchem檢索出所有活性成分各自的3D結構，保存為mol2格式。

1.2活性成分作用靶標及骨質疏松作用靶標相應基因的獲取反向分子對接服務器（DRAR-CPI）是可以基于反向分子對接方法，對藥物活性成分與蛋白的作用強度進行打分的服務器[14]。將上述檢索所得的杜仲治療骨質疏松的活性成分的mol2格式導入DRAR-CPI，按服務器所推薦，選取Z-score＜-0.5的蛋白作為杜仲活性成分的預測靶標。于UniProt數據庫中檢索“杜仲”蛋白靶標的蛋白數據庫（PDB）ID，限定物種為“Human”，從而得到相應的基因靶標。以“osteoporosis”或“OP”作為關鍵詞在GeneCards數據庫和在線人類孟德爾遺傳（OMIM）數據庫中進行檢索，收集與骨質疏松相關的靶標基因，并與上述檢索所得的杜仲的活性成分作用的靶標基因進行比對，以篩選出共同靶標。

1.3成分——靶標作用網絡構建與分析將杜仲的活性成分與抗骨質疏松作用靶標導入Cytoscape 3.6.0軟件，構建其“成分——靶標”網絡。

1.4核心靶標相互作用網絡構建與分析在String數據庫中檢索杜仲治療骨質疏松的潛在靶標獲取相互作用關系，將其導入Cytoscape 3.6.0軟件，繪制蛋白相互作用關系網絡，使用Cytoscape的Network Analyzer功能對其進行網絡分析，調節節點大小的顏色以反映Degree的大小，最終獲得蛋白相互作用網絡圖。

1.5分子對接Systems Dock Web Site分子對接服務器是基于DocK-IN評分的分子對接功能對蛋白質——配體結合潛力進行評估[15]。篩選上述Degree值排名前5位的靶標，將其導入Systems Dock Web Site分子對接服務器中與杜仲的活性成分進行分子對接，并分析分子對接結果的Docking Score，用于對杜仲活性成分與核心靶標之間結合活性的評價。

1.6生物學過程與通路分析利用DAVID數據庫對杜仲的作用靶標進行基因本體論（GO）分析與京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，得到通路富集結果，選取其中P＜0.001的通路，將富集基因數按降序排列，選取前20名的通路，利用OmicShare網站繪制通路信息圖。

1.7成分——靶標——通路網絡構建通過分析排名前20的KEGG通路，結合文獻檢索，篩選出其中可能與治療骨質疏松相關的通路，找出富集在上述通路上的杜仲抗骨質疏松的潛在靶標，并與相應的活性成分相對應，最終構建“成分——靶標——通路”多維網絡關系圖。

2 結果

2.1杜仲活性成分分析在TCMSP數據庫中收集杜仲的化學成分，以OB＞30%，DL＞0.18為篩選標準，得到具有抗骨質疏松作用的活性成分28個，具體見表1。

2.2靶標預測在DRAR-CPI服務器中搜索杜仲28個活性成分對應的潛在靶標，共獲得386個，剔去重復靶標后獲得265個潛在靶標。在Uniprot數據庫中輸入潛在靶標的PDB ID，得到基因靶標123個。通過OMIM、GeneCards數據庫中骨質疏松相關基因的比對，篩選出可能有抗骨質疏松作用的潛在靶標61個，具體見表2。

2.3成分——靶標網絡構建在Cytoscape軟件中輸入活性成分與潛在靶標的相關數據，構建杜仲的成分——靶標網絡，見圖1。圖中涉及節點80個，邊387條。不同的節點代表的意義不同，橙色六邊形節點表示活性成分，藍色圓形節點表示潛在靶標，邊表示活性成分與潛在靶標之間互相關聯。由成分——靶標網絡可知，杜仲治療骨質疏松具有多成分、多靶標的特點，非單一成分、單一靶標作用而成。

2.4靶標相互作用網絡構建使用String數據庫獲取杜仲與骨質疏松相關靶標的相互作用關系，導入Cytoscape軟件，構建靶標相互作用網絡，見圖2。網絡中的節點代表蛋白靶標，邊代表蛋白靶標之間的相關性。蛋白靶標的Degree值大小通過節點顏色和大小來體現，節點越大、顏色越深說明Degree值越大。由圖2可知靶標相互作用網絡共涉及節點61個，邊453條。通過Degree值與現有研究結果推測杜仲抗骨質疏松作用與甲狀旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）、骨鈣素（bone Gla protein，BGP）、過氧化物酶增殖物激活受體γ（peroxisome proliferators-activated receptor，PPAR）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、Runt相關轉錄因子2（runt-related protein 2，RUNX2）有關。

2.5分子對接選取靶標相互作用網絡中Degree值靠前的5個靶標PTH、BGP、PPAR、ALP、RUNX2，通過Systems Dock Web Site軟件與杜仲的28個活性成分進行分子對接，結果Docking Score值＞7.0的有10個（7%），在7.0～5.0之間的有76個（54%），在4.25～5.0之間的有38個（27%），＜4.25的有16個（11%）。Docking Score值＞4.25表示分子和靶標具有一定的結合能力，＞5.0表示結合能力較高，＞7.0表示結合能力很高，見圖3。因此，分子對接驗證結果提示，杜仲的活性成分和靶標之間具有良好的結合能力。

表1 杜仲活性成分表Table 1 Active components of Cortex Eucommiae

2.6 GO和KEGG通路富集分析對杜仲活性成分的相應靶標進行GO和KEGG通路富集分析，以P＜0.05為閾值，篩選出靠前的通路與生物過程（見圖4～7）。GO富集分析包括細胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）、生物過程（biological process，BP）3部分。結果BP分析排名較前的為Wnt信號通路（Wnt signaling pathway），鈣調節通路（calcium modulating pathway）、蛋白激酶活性激活（activation of protein kinase activity）、流出道形態發生（outflow tract morphogenesis）、化學突觸傳導（chemical synaptic transmission）、凋亡程序正調控（positive regulation of apoptotic process），見圖4。MF分析排名較前的為Wnt激活受體活性（Wnt-activated receptor activity）、細胞因子活性（cytokine activity）、速激肽受體活性（tachykinin receptor activity）、蛋白異源二聚體活性（protein heterodimerization activity）、酶綁定（enzyme binding），見圖5。CC分析排名較前的為受體復合物（receptor complex）、神經細胞體（neuronal cell body）、 側 漿 膜（lateral plasma membrane）、細胞皮層（cell cortex）、高爾基腔（Golgi lumen），見圖6。KEGG通路富集分析結果顯示杜仲治療骨質疏松的靶標主要與磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/絲蘇氨酸蛋白激酶Akt、血管內皮生長因子（VEGF）、腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）、叉頭框蛋白O（FoxO）信號通路及人嗜T淋巴細胞病毒I型（HTLV-I）感染等相關，見圖7。

表2 杜仲潛在靶標信息列表Table 2 The information of the candidate targets of Cortex Eucommiae

圖1 杜仲成分——靶標網絡Figure 1 The component-target network of Cortex Eucommiae

圖2 杜仲靶標相互作用網絡Figure 2 The candidate target interaction network of Cortex Eucommiae

圖3 分子對接圖Figure 3 The diagram for molecular docking

圖4 杜仲活性成分對應靶標的BP分析Figure 4 The analysis for biological processes of candidate targets of active components in Cortex Eucommiae

圖5 杜仲活性成分對應靶標的CC分析Figure 5 The analysis for cellular component of candidate targets of active components in Cortex Eucommiae

圖7 杜仲活性成分對應靶標的KEGG通路富集分析Figure 7 KEGG pathway enrichment analysis for candidate targets of active components in Cortex Eucommiae

2.7杜仲成分——靶標——通路網絡構建依據現有研究成果篩選出可能具有抗骨質疏松作用的通路，將其與杜仲的活性成分與潛在靶標一一對應，構建成分——靶標——通路多維網絡，見圖8。由圖8分析可得，杜仲治療骨質疏松涉及的活性成分共12個。這些活性成分作用的靶標包括PTH、BGP、PPAR、ALP、RUNX2等共35個，主要涉及PI3K-Akt、VEGF、AMPK、Notch、核因子kappa B（NF-κB）、FoxO、HTLV-I等7個信號通路。

3 討論

杜仲屬杜仲科植物，有補益肝腎、強筋壯骨、安胎元之效[16]。《神農本草經》記載其“主治腰膝痛，補中，益精氣，堅筋骨”。近年來許多動物實驗與體外實驗結果表明，杜仲通過提高雌激素水平、調節骨代謝相關細胞因子以及促進護骨素形成等發揮抗骨質疏松作用，但其機理尚未明確[17]。因此，研究杜仲治療骨質疏松的分子作用機制具有較大的意義。

本研究收集到杜仲中具有抗骨質疏松作用的化學成分主要是槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、Mairin、olivil、Eucommin A、Cyclopamine、liriodendrin-qt、D6、D3、Helenalin、Yangambin、D1等。如杜仲中的槲皮素能使ERK磷酸化激活，促進骨髓間充質干細胞增殖[18]。山柰酚能夠增加骨密度，使骨質疏松的骨微結構得到改善，其抗骨質疏松作用強于槲皮素[19]。

圖8 杜仲“成分——靶標——通路”多維網絡關系圖Figure 8 The component-target-pathway network for Cortex Eucommiae

本研究發現，杜仲可能通過調節PTH、BGP、PPAR、ALP、RUNX2等靶標達到治療骨質疏松的目的。如PTH可刺激骨形成、增大骨密度、改善骨質疏松微結構、逆轉骨退化，而PTH類藥物也已作為一種骨形成促進劑應用于原發性骨質疏松癥的預防治療[20]。BGP水平降低可影響骨代謝，加快骨吸收，進而對骨質疏松的發生產生影響[21]。PPAR即過氧化物酶體增長因子活化受體，其亞型PPARγ2與配體可調節脂代謝來影響骨代謝平衡，減少成骨細胞，導致骨質疏松[22]。骨ALP是骨形成中的一種主要功能酶，是骨形成、骨轉換的標志物[23]。RUNX2為Runt基因家族里的轉錄因子，它可調節破骨細胞、成骨細胞和基質蛋白等的生理活動來影響骨質疏松的發生發展[24]。

本研究結果顯示，杜仲治療骨質疏松的過程可 能 涉 及 PI3K-Akt、 VEGF、 AMPK、 Notch、NF-κB、FoxO、HTLV-I等信號通路。PI3K/Akt信號通路是機體細胞生長、增殖與抗凋亡的一個重要調節因素[25]，有研究認為它可能是成骨細胞與破骨細胞增殖、分化、凋亡調控的中心，能影響骨轉換的平衡[26]。VEGF是血管中的一種生長因子，可影響內皮、血管和骨骼的合成與生長，還可影響骨骼構成和骨骼替換[27]。AMPK是胞內能量感受器、能量與代謝平衡調節器，它也可調節骨組織代謝。AMPK可能通過成骨分化、骨吸收與破骨細胞活化等生理活動的調節，影響骨質疏松的發生發展[28]。Notch信號通路主要參與了機體的生長發育和細胞分化[29]。此信號通路的減弱常和絕經后骨質疏松女性的骨髓間充質干細胞增殖、分化能力減弱相關，可能是導致骨量降低的因素[30]。NF-κB是與多種炎癥相關的轉錄因子，炎癥細胞因子通過促進破骨細胞的生成與分化，導致了骨的生成與吸收之間的平衡，使得骨質減少加速，骨質減少，最終出現骨質增生或者骨折[31]。FoxO在骨代謝中通過減少成骨細胞中自由氧濃度提高抗氧化能力，同時可以促進成骨細胞分化，來預防骨質疏松[32]。HTLV-I感染后患者有20%～30%發生高鈣血癥，甲狀旁腺相關蛋白（PTHrP）的產生是出現高鈣血癥的主要原因，由Tax反式激活PTHrP基因表達會促進骨質的分解，造成骨質疏松[33]。因此，杜仲可能通過PI3K-Akt、VEGF、AMPK、Notch、NF-κB、FoxO、HTLV-I等信號通路來調節骨細胞的各種生理活動，達到治療骨質疏松的目的。

本研究通過網絡藥理學方法分析杜仲治療骨質疏松的有效化學成分和作用機制，通過相關網絡圖的構建可直觀地顯示出杜仲治療骨質疏松具有多成分，多層次，多途徑共同作用的特點，符合中醫藥治療疾病的特色，相比于西藥的單一作用機制，其優勢明顯。分子對接模擬試驗結果顯示本次研究數據較為準確，具有較高的可信度。網絡藥理學分析結果也與現有研究結果基本一致。但利用網絡藥理學方法研究杜仲抗骨質疏松的機制，僅是基于分子機制的預測，后期我們將在此研究結果的基礎上，借助學校動物實驗中心以及附屬醫院為平臺，開展進一步的動物實驗以及臨床試驗研究，以驗證其具體作用機制。