芹菜素對肺癌PC9GR細胞侵襲和遷移的抑制作用及機制

李 彬 蔡 悅 陳 匯*

（1 華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院藥學部，湖北 武漢 430030；2 華中科技大學同濟醫學院基礎醫學院藥理學系，湖北 武漢 430030）

芹菜素 （4'，5，7-trihydroxyflavone，Apigenin，APG），又名芹黃素，是一種天然黃酮類化合物，廣泛存在于多種植物如旱芹、洋甘菊、紫蘇、馬鞭草中［1］。國內外大量研究發現，芹菜素是天然抗氧化劑，具有降血壓和舒張血管、預防動脈粥樣硬化等抗心血管病作用［2］。近年來，芹菜素在抗腫瘤方面的作用逐漸被發現和認可。研究表明，芹菜素對乳腺癌、前列腺癌、肝癌、肺癌等實體腫瘤均具有抑制作用［3-8］。在乳腺癌和肺癌中，芹菜素對一些化療藥物也顯示出增敏或逆轉耐藥作用［4，9-10］。與其他黃酮類化合物（槲皮素、山奈黃酮）相比，芹菜素具有低毒、無誘變性等特點［11］。因此，芹菜素作為天然高效且低毒的抗腫瘤藥物，已成為目前腫瘤輔助治療領域的研究熱點之一。本研究在PC9GR細胞中探究芹菜素對肺癌細胞侵襲和遷移能力的影響，并初步研究相關分子機制，以期為晚期肺癌治療提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 芹菜素（HPLC≥98%，標準品） 購自大連美侖生物技術有限公司，DMEM高糖培養基、PBS緩沖液購買于Hyclone公司，胎牛血清來自浙江天杭生物科技股份有限公司，CCK-8試劑盒購買于武漢莊盟生物科技有限公司，Transwell板、Matrigel基質膠購于美國Corning公司，蛋白提取相關試劑均來自上海碧云天生物技術有限公司。實驗用兔抗人E-cadherin抗體、兔抗人N-cadherin抗體、兔抗人MMP-9抗體、兔抗人MMP-2抗體購買于CST公司，兔抗人Snail抗體、鼠抗人Slug抗體、兔抗人VEGF抗體為美國Santa Cruz公司，鼠抗人 β-actin抗體來自Abbkine，羊抗兔、鼠抗兔IgG購于武漢大風生物科技有限公司。本研究所用PC9GR細胞為逐步誘導所得，由我院胸外科實驗室饋贈。實驗用水為超純水，所用其他化學試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養及形態觀察 PC9GR細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基中，置于37℃，5%CO2細胞培養箱中培養。將對數生長期細胞隨機分組，以2×105個/孔接種于六孔板。細胞貼壁24 h后，將孔內培養基替換為含藥培養基。實驗組分別加入含有10 μmol/L、20 μmol/L芹菜素的培養基，陰性對照組加入含0.1%DMSO的完全培養基。培養48 h后，將六孔板置于Olympus IX71倒置顯微鏡白光下觀察細胞形態，使用Image-Pro Plus IPP 7.0圖象分析軟件對細胞形態進行圖像采集。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞存活率 取生長狀態良好細胞，消化計數后以3×103個/孔將細胞均勻接種至96孔板中，置于37℃培養箱中培養。細胞貼壁24 h后，將各孔培養基替換為含藥培養基。其中10 μmol/L組、20 μmol/L 組分別加入含有 10 μmol/L、20 μmol/L 芹菜素的培養基，陰性對照組加入含0.1%DMSO的完全培養基，每組設5個復孔。培養48 h后，吸除孔內培養基，用不含血清的培養基漂洗2遍 。每孔加入 100 μL含10%CCK-8的培養基，37℃繼續培養2 h。采用全自動酶標儀在450 nm波長處測量各孔吸光度值，計算細胞存活率。

1.2.3 Transwell實驗檢測細胞侵襲和遷移能力 取生長狀態良好細胞，消化計數后用無血清的培養基重懸細胞，調整懸液濃度，以每孔5×104個的密度將細胞接種至預鋪好Matrigel的Transwell小室的上室，下室中加入含藥培養基。10 μmol/L 組、20 μmol/L 組分別加入含 10 μmol/L、20 μmol/L芹菜素的培養基，陰性對照組為含0.1%DMSO的完全培養基。每組設3個復孔，遷移實驗無需鋪膠。將Transwell板置于37℃培養48 h（侵襲實驗） 或24 h（遷移實驗）。細胞侵襲和遷移完成后，用培養基潤濕的棉簽輕輕拭去上室表面的細胞，移出小室。用4%多聚甲醛固定后將小室置于0.1%結晶紫溶液中，浸潤染色30 min。光學倒置顯微鏡下隨機選取5個視野，拍照并統計穿膜細胞數目，取平均值。

1.2.4 Western blot檢測相關蛋白的表達 采用Western blotting 檢測 E-cadherin、N-cadherin、Snail、Slug、MMP-9、MMP-2及VEGF等相關蛋白的表達。取對數生長期細胞，以適當密度接種于培養皿。細胞分組及給藥同1.2.1。常規培養48 h后，收集細胞。將培養皿置于冰上，加入適量含PMSF的RIPA細胞裂解液，置于冰上裂解5 min，提取細胞總蛋白液。按 BCA法測定蛋白濃度后，加入上樣緩沖液，100℃水浴變性。將蛋白樣品進行10%SDS-PAGE電泳后，PVDF膜轉膜，5%脫脂奶粉封閉2 h。加入適量一抗稀釋液，4℃孵育過夜。漂洗后加入適量HRP標記的二抗，室溫孵育 2 h后，ECL化學發光法顯影。結果采用Gel-Pro圖像分析軟件讀取目的條帶灰度值，以β-actin為內參 ，計算目的蛋白與對應內參灰度值的比值，將其作為目的蛋白的相對表達量。

1.3 統計學方法 統計學分析采用SPSS 22.0統計軟件處理，本研究實驗均重復3次，所有數據以平均值±標準差表示，組內數據采用t檢驗分析，組間比較采用ANOVA方差分析。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 芹菜素對PC9GR細胞存活率的影響 在PC9GR細胞中加入不同濃度 （10 μmol/L、20 μmol/L） 芹菜素處理48 h后，觀察細胞形態，采用CCK-8法檢測細胞存活率。結果顯示，和陰性對照組相比，2個濃度組芹菜素作用后PC9GR細胞存活率均有一定程度的降低，其中20 μmol/L組差異具有統計學意義（P＜0.05）。芹菜素組PC9GR細胞形態趨向延展，體積增大，上皮樣特征增強（見圖 1）。

圖1 不同濃度芹菜素對PC9GR細胞形態和細胞存活率的影響（100×）

2.2 芹菜素對PC9GR細胞侵襲和遷移能力的影響 經不同濃度 （10 μmol/L、20 μmol/L） 芹菜素處理后，觀察并統計細胞穿膜數目，以檢測細胞侵襲和遷移能力的變化。如圖所示，和陰性對照組相比，10 μmol/L和20 μmol/L芹菜素組中細胞穿膜數目顯著減少（均P＜0.05），細胞侵襲能力降低，并且20 μmol/L組明顯低于10 μmol/L組（圖2.A）。細胞遷移實驗顯示，和陰性對照組相比，10 μmol/L和20 μmol/L芹菜素組中細胞穿膜數目也明顯減少（均 P＜0.05），細胞遷移能力降低（圖2.B）。上述結果提示芹菜素明顯降低PC9GR細胞的侵襲和遷移能力。

圖2 不同濃度芹菜素對PC9GR細胞侵襲（A）和遷移（B）的影響（100×）

2.3 芹菜素對EMT相關蛋白表達的影響 不同濃度（10 μmol/L、20 μmol/L） 芹菜素干預 48 h 后，將提取的細胞總蛋白進行Western blot檢測。和陰性對照組相比，10 μmol/L和20 μmol/L芹菜素組中，PC9GR細胞中上皮標志物E-cadherin蛋白表達顯著上調（P＜0.05），并且具有濃度依賴性。與EMT相關的轉錄因子中，Snail表達顯著減少（P＜0.05）。另外，和腫瘤轉移有關的金屬基質蛋白酶MMP-9和血管內皮生長因子VEGF蛋白表達也明顯減少（P＜0.05）。在上述濃度芹菜素作用下，PC9GR細胞中間充質標志物N-cadherin，轉錄因子Slug及金屬基質蛋白酶MMP-2的蛋白表達變化均不明顯（P＞0.05）。

圖3 不同濃度芹菜素對EMT相關蛋白表達的影響

3 討論

肺癌是我國近年來發病率和病死率均較高的惡性腫瘤［12］，其死亡率較高的主要原因有容易復發轉移和產生化療抵抗［13-14］。眾所周知，腫瘤細胞的侵襲和轉移能力增強是腫瘤復發轉移的必要條件，往往伴隨著細胞形態學特征的變化［15］。對晚期肺癌患者來說，抑制腫瘤復發和轉移的速度能顯著延長患者的生存期和提升生活質量［14，16］。諸多研究表明，芹菜素對卵巢癌、前列腺癌和肝癌等腫瘤都具有抑制侵襲和轉移的作用［3，17-19］。芹菜素可抑制肺癌細胞增殖和誘導凋亡，但其對肺癌侵襲和轉移的影響目前尚無報道。本研究發現，濃度為10 μmol/L和20 μmol/L的芹菜素可顯著抑制肺癌PC9GR細胞的侵襲能力和轉移能力。在該作用濃度下，芹菜素對PC9GR細胞的生長僅產生較弱的抑制作用，因而可減少增殖抑制作用對侵襲和轉移的影響。同時，研究發現芹菜素處理可增強PC9GR細胞的上皮形態特征，這與上述結果一致。本研究結果提示，芹菜素具有抑制肺癌轉移的潛力，為晚期肺癌的治療可提供參考。

研究表明，芹菜素可通過上調PTEN蛋白表達［20］、調控 Wnt信號通路［21］、影響 Akt信號［7，22］等途徑發揮抗腫瘤作用。本研究中芹菜素可明顯抑制PC9GR細胞的侵襲和轉移能力，增強其上皮形態特征，但這些作用是如何產生的尚不清楚。通過檢測PC9GR細胞中EMT標志物及相關轉錄因子，我們發現芹菜素可顯著促進上皮標志物E-cadherin的表達，并且呈濃度依賴性，同時下調下游轉錄因子Snail的蛋白表達。E-cadherin表達增加與細胞上皮樣形態特征增強是一致的，這進一步證實了芹菜素對侵襲和轉移的抑制作用。芹菜素干預對間充質標志物N-cadherin及其他下游轉錄因子Slug影響不明顯，可能是因為它們不是芹菜素的主要作用靶點。另外，和腫瘤轉移有關的金屬基質蛋白酶MMP-9和血管內皮生長因子VEGF蛋白表達也明顯減少。上述結果表明芹菜素可能通過影響多種信號途徑降低肺癌細胞的侵襲和轉移能力。至于芹菜素究竟是如何影響上述蛋白表達的，值得我們進一步研究。有文獻報道E-cadherin在肺癌細胞中的表達具有表觀遺傳調控的可能［23］，這可能成為我們深入研究的方向。

既往報道表明芹菜素對腫瘤細胞具有多種抗腫瘤作用，而誘導細胞凋亡和增殖抑制作用是芹菜素發揮抗癌作用的主要途徑。研究表明芹菜素還可抑制結腸癌SW620細胞和肝癌Hepg2細胞的葡萄糖攝取［24-25］，干擾其能量代謝，進而影響細胞增殖和凋亡等過程。另外，芹菜素還可通過誘導細胞產生自噬［26］，對抑癌基因的表觀遺傳調控［27］以及對化療藥物的增敏作用［10］等途徑產生抗腫瘤作用。腫瘤復發和轉移是肺癌治療的難點之一，PC9GR細胞作為吉非替尼耐藥細胞株，具有較強轉移能力，是研究晚期肺癌治療的良好載體。本研究表明10 μmol/L和20 μmol/L的芹菜素可顯著抑制PC9GR細胞的侵襲能力和轉移能力，并且在該較低濃度下不會產生明顯細胞毒性作用，這為芹菜素在肺癌治療中的應用又提供了有益參考。結合芹菜素可抑制乳腺癌和肝癌等多種腫瘤侵襲能力的事實，芹菜素的抗腫瘤轉移作用值得深入研究。

綜上，本研究表明芹菜素可抑制肺癌PC9GR細胞的侵襲和遷移能力，并且這可能與上調E-cadherin的表達，減少Snail、MMP-9以及VEGF的表達有關。至于芹菜素在體內的抗肺癌轉移作用如何，以及和其他抗腫瘤藥物的聯合應用，將是我們接下來將要研究的內容。