棗莊黑蓋豬親緣關(guān)系分析及分子系譜構(gòu)建

王繼英，成建國(guó)，林 松，王彥平，趙雪艷，武 英，朱曉東，謝晉堂，方美英

（1. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250100；2.山東春藤食品有限公司棗莊黑蓋豬原種豬場(chǎng)，山東 棗莊 277100；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，北京 100193）

畜禽系譜記錄的準(zhǔn)確性對(duì)控制畜禽近交系數(shù)增加、遺傳改良至關(guān)重要。由于未知血緣個(gè)體的引進(jìn)、記錄過(guò)程中的人為失誤等原因，系譜記錄錯(cuò)誤在畜禽生產(chǎn)、育種和保種過(guò)程中普遍存在。奶牛的系譜研究最多。Banos 等[1]研究表明國(guó)外奶牛系譜平均錯(cuò)誤率約為11%，初芹等[2]評(píng)估了我國(guó)荷斯坦牛群體的系譜，發(fā)現(xiàn)中國(guó)荷斯坦牛群平均系譜錯(cuò)誤率為16.62%。除奶牛外，系譜錯(cuò)誤在其他畜種中也有研究報(bào)道。2014 年，張哲等[3]對(duì)某個(gè)杜洛克豬群體進(jìn)行系譜分析，發(fā)現(xiàn)其系譜的錯(cuò)誤率為6%。

錯(cuò)誤的系譜信息會(huì)導(dǎo)致遺傳評(píng)定準(zhǔn)確性大大降低，減慢群體的遺傳進(jìn)展，比系譜缺失帶來(lái)更大的育種損失[4]。同時(shí)，錯(cuò)誤的系譜信息也會(huì)影響基因定位和基因組選擇等其他利用系譜信息的研究可靠性。對(duì)地方畜禽保種群體而言，保種豬來(lái)源主要從不同個(gè)體養(yǎng)豬從業(yè)者搜集而來(lái)，難以得到準(zhǔn)確的個(gè)體親緣信息。另外，很多地方品種的系譜記錄不完全、系譜信息錯(cuò)誤多，甚至無(wú)系譜。不完整或錯(cuò)誤的系譜信息會(huì)使群體近交系數(shù)過(guò)快增加，從而加速群體近交退化導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

近年來(lái)，單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP）作為新一代分子標(biāo)記，具有基因組覆蓋度高、分布范圍廣、分型準(zhǔn)確性高和成本低等特點(diǎn)，逐漸成為人類(lèi)及動(dòng)植物親緣關(guān)系鑒定及遺傳研究中最常用的分子標(biāo)記。隨著測(cè)序及生物芯片技術(shù)的進(jìn)步，目前已有多種豬的商業(yè)化SNP 芯片陸續(xù)推出，使得從全基因組層面上研究地方豬種的遺傳結(jié)構(gòu)和系譜特征成為可能。

棗莊黑蓋豬，俗稱(chēng)“蓋子豬”，是在獨(dú)特的地理氣候條件、自然資源及人文環(huán)境下形成的地方豬遺傳資源。從20 世紀(jì)80 年代開(kāi)始，隨著外來(lái)品種的引進(jìn)，棗莊黑蓋豬不斷地被淘汰，養(yǎng)殖數(shù)量越來(lái)越少，一度處于瀕危的邊緣。2004年，在山東省畜牧獸醫(yī)局、滕州市畜牧獸醫(yī)局、山東省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所和山東農(nóng)業(yè)大學(xué)支持下，山東春藤食品有限公司對(duì)棗莊黑蓋豬這一古老豬種資源進(jìn)行保護(hù)性地發(fā)掘、繁育、提純和復(fù)壯。2019 年3 月，棗莊黑蓋豬通過(guò)國(guó)家畜禽遺傳資源委員會(huì)遺傳資源鑒定。本研究利用全基因組范圍內(nèi)高密度的SNP 標(biāo)記，對(duì)棗莊黑蓋豬核心群樣本進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析并構(gòu)建家系，為該豬種的保護(hù)利用提供了分子水平的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)

試驗(yàn)于2018 年10 月在棗莊黑蓋豬場(chǎng)采集樣本，2018 年11 月份委托北京康普森生物技術(shù)有限公司進(jìn)行SNP 基因型測(cè)定。2018 年底在山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2 試驗(yàn)材料

棗莊黑蓋豬核心群200 頭公、母豬，用耳號(hào)鉗剪取少許耳組織放入離心管中，加入75%酒精浸泡，-20 ℃保存以備基因組DNA 提取。

1.3 基因型測(cè)定

利用血液/ 組織/ 細(xì)胞基因組提取試劑盒（DP304，天根生化科技有限公司）提取待測(cè)樣本基因組DNA，經(jīng)Nanodrop（260/280在1.7 ～2.1 范圍之間，濃度＞50 ng/ul）和瓊脂糖凝膠電泳（條帶清晰）檢測(cè)合格后，委托北京康普森生物技術(shù)有限公司利用Illumina CAUPorcineSNP50 BeadChip 芯片進(jìn)行基因組SNP 測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1 SNP 質(zhì)量控制

利 用PLINK v1.90[5]按 照 以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行質(zhì)控：1）去除檢出率小于0.95 的SNP 標(biāo)記（命令：plink--file myfile--geno 0.05）；2）去除最小等位基因頻率（Minor allele frequency, MAF）小于0.05（命令：plink--file myfile--maf 0.05） 的SNP 標(biāo)記。質(zhì)量控制后剩余SNP 用于后續(xù)分析。

1.4.2 群體結(jié)構(gòu)與親緣關(guān)系分析

基于質(zhì)控后的SNP 數(shù)據(jù)，利用PLINK v1.90[5]進(jìn)行主成分分析（Principal component analysis，PCA）（ 命 令：plink--file myfile --pca 4），并利用R 軟件繪制第一主成分與第二主成分的二維圖?；诨蚪M同源相同（Identity-by-descent，IBD）信息，利用PLINK v1.90[5]（命令plink--file myfile--genome）評(píng)估棗莊黑蓋豬群體個(gè)體對(duì)間親緣系數(shù)及家系內(nèi)個(gè)體對(duì)親緣系數(shù)。

1.4.3 群體系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)分析和分子系譜劃分

利用MEGA7 軟件[6]，采用鄰接法（Neighbour joining, NJ）繪制棗莊黑蓋豬核心群樣本的分子系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)?；谙到y(tǒng)發(fā)生樹(shù)，劃分各個(gè)家系，構(gòu)建分子系譜。

1.4.4 群體和家系的遺傳多樣性分析

利用PLINK v1.90[5]對(duì)棗莊黑蓋豬整個(gè)群體和各個(gè)家系進(jìn)行觀察雜合度（Observed heterozygosity, HO）和期望雜合度（Expected heterozygosity, HE）（ 命 令：plink--file myfile--hardy）等遺傳多樣性指標(biāo)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SNP 質(zhì)量控制

研究采用Illumina CAUPorcin eSNP55 BeadChip 芯片，對(duì)棗莊黑蓋豬基因組SNP 進(jìn)行掃描分型，共檢測(cè)出43 832 個(gè)SNP 位點(diǎn)。其中39 140 個(gè)SNP 通過(guò)質(zhì)量控制可用于后續(xù)分析。質(zhì)控后每條染色體的SNP 數(shù)目及SNP 間隔距離如圖1所示?？梢钥闯觯煌旧wSNP間隔距離分布較為均衡，平均為66.23 kb。由于染色體長(zhǎng)度差異，不同染色體SNP 數(shù)量變化較大，1 號(hào)染色體SNP 數(shù)目最多為4 646 個(gè)，18號(hào)染色體SNP數(shù)目最少為996個(gè)。

2.2 種群親緣關(guān)系分析

首先利用質(zhì)控后SNP 數(shù)據(jù)，對(duì)200 個(gè)樣本進(jìn)行主成分分析，初步了解棗莊黑蓋豬群體遺傳結(jié)構(gòu)。圖2 為根據(jù)主成分1 和主成分2 繪制的散點(diǎn)圖?？梢钥闯?，棗莊黑蓋豬樣本在圖中的分布很不均勻，其中第2 主成分中左側(cè)的個(gè)體比較緊密，表明這些棗莊黑蓋豬的親緣關(guān)系較近。

利用基因組IBD 信息進(jìn)一步評(píng)估棗莊黑蓋豬樣本全部個(gè)體對(duì)的親緣系數(shù)。200 個(gè)樣本可以形成19 900 個(gè)關(guān)系對(duì)，其平均親緣系數(shù)為0.103 2。其中，85.84% 個(gè)體對(duì)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（親緣系數(shù)≤0.25），13.30%個(gè)體對(duì)親緣關(guān)系較近（親緣系數(shù)0.25 ～0.5），另有0.86%個(gè)體對(duì)親緣關(guān)系很近（親緣系數(shù)≥0.5），這些個(gè)體對(duì)之間交配極有可能使隱性不良基因純合造成近交衰退。故對(duì)于這部分親緣系數(shù)較大或很大的個(gè)體對(duì)，選配時(shí)需要格外注意避開(kāi)。

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析及家系構(gòu)建

為研究棗莊黑蓋豬樣本的家系組成，基于芯片數(shù)據(jù)對(duì)棗莊黑蓋豬進(jìn)行群體分子系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)分析。圖3 為采用NJ 法繪制的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，可以看出，棗莊黑蓋豬在分子系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)上聚集成幾個(gè)獨(dú)立的大分支，這些分支可以作為家系劃分的依據(jù)。另外，還有一些小分支，數(shù)量多，每個(gè)支內(nèi)的樣本數(shù)少，不作為單獨(dú)家系劃分。綜合考慮系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)的分支和公豬分布，把棗莊黑蓋豬分成了8 個(gè)家系，分別用紅色、藍(lán)色、淺綠色、黃色、紫色、灰色、黑色和墨綠色表示。

圖1 質(zhì)量控制后SNP 在各染色體上的數(shù)量及間隔距離

圖2 棗莊黑蓋豬種群的主成分分析結(jié)果

各家系樣本量、遺傳多樣性、親緣系數(shù)信息詳見(jiàn)表1。家系樣本量變化較大，家系3 樣本量最大為38 個(gè)，家系1 樣本量最小為18。由于家系劃分時(shí)考慮了公豬的分布，公豬分配較均勻，有利于后期配種計(jì)劃的制定。不同家系的遺傳多樣性變化較小，最大為0.358 5，最小為0.253 7。不同家系內(nèi)個(gè)體對(duì)親緣系數(shù)變化較大，其中，家系4 的親緣系數(shù)最高（0.340 7），其次為家系1（0.323 6），這與兩個(gè)家系樣本量小，在系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)上聚集最為緊湊相一致；家系6 的親緣系數(shù)最?。?.140 0），這與該家系由4 個(gè)相對(duì)獨(dú)立分支組成有關(guān)。家系內(nèi)個(gè)體對(duì)親緣系數(shù)均明顯大于整個(gè)群體的個(gè)體對(duì)親緣系數(shù)（0.103 2），故為避免群體近交系數(shù)過(guò)快增長(zhǎng)，制定配種計(jì)劃時(shí)，應(yīng)家系間個(gè)體交配，盡量避免同一家系內(nèi)個(gè)體之間的交配。

3 結(jié)論

本研究利用基因組上39 140 個(gè)SNP 標(biāo)記，對(duì)棗莊黑蓋豬核心群進(jìn)行了群體結(jié)構(gòu)、親緣系數(shù)、系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)等遺傳分析及分子系譜構(gòu)建，結(jié)果表明棗莊黑蓋豬的親緣關(guān)系分布很不均勻，部分個(gè)體對(duì)親緣系數(shù)大，親緣關(guān)系較近，在選配過(guò)程中，如不能避開(kāi)這些個(gè)體之間的交配可能造成近交現(xiàn)象。棗莊黑蓋豬在分子系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)上聚集成幾個(gè)獨(dú)立的分支，綜合考慮系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)的分支和公豬分布，把棗莊黑蓋豬分成了8 個(gè)家系，不同家系內(nèi)個(gè)體對(duì)親緣系數(shù)變化較大，但均明顯大于群體的個(gè)體對(duì)親緣系數(shù)。為避免群體近交系數(shù)過(guò)快增長(zhǎng)，棗莊黑蓋豬選配時(shí)，應(yīng)盡量避免同一家系內(nèi)個(gè)體之間的交配。

表1 棗莊黑蓋豬各家系遺傳多樣性、親緣系數(shù)信息

圖3 基于基因組SNP 構(gòu)建的棗莊黑蓋豬NJ 系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)