布美他尼與呋塞米K+轉運蛋白抑制劑對小鼠聽覺功能的影響

錢迪 鄭偉昌 敬光懷 陳翠霞 黃俊煊 湯國棟

（廣東省深圳市龍華區人民醫院耳鼻喉科 深圳518109）

鈉鉀氯協同轉運蛋白1（NKCC1）是中樞神經系統內分布于微血管內皮細胞、神經元細胞膜及星形膠質細胞上的離子轉運蛋白，不僅對維持神經元細胞及星形膠質細胞內離子的正常濃度、細胞容積及維持血腦屏障通透性具有重要的意義，還是參與耳蝸K+循環生理機制，對聽覺生理功能進行維護的重要功能通道。有相關研究報道證實，NKCC1 蛋白的低表達在聽覺功能損傷中發揮了重要的作用[1]。布美他尼、呋塞米是目前臨床上應用較為廣泛的兩類抑制NKCC1 蛋白的K+轉運蛋白抑制劑。本研究以30 只健康小鼠為研究對象，以對比布美他尼、呋塞米對NKCC1 蛋白的抑制作用，探討布美他尼/呋塞米兩類K+轉運蛋白抑制劑對小鼠聽覺功能的影響。現報道如下：

1 材料與方法

1.1 材料 選取由我市動物中心提供的30 只健康小鼠為研究對象，小鼠經近交自行繁殖培育，均系12 周齡，可保持長時間穩定的聽力，體質量12～18 g，平均（15.41±4.33）g。采用隨機數字表法將30 只小鼠分為健康對照組10 例，布美他尼處理組10 例，呋塞米處理組10 例。

1.2 研究方法 （1）聽覺腦干反應（ABR）檢測。布美他尼處理組10 只小鼠和呋塞米處理組10 只小鼠，予以三溴乙醇腹腔注射麻醉，用量0.53 mg/g。采用銀針電極，于頭頂正中皮下插入正極，于左耳皮下插入參考電極，于右耳皮下插入地極電極。ABR 檢測儀器采用美國產ABR 儀，刺激參數設置由電腦產生設定的短聲、短純音的8、16、32 kHz 為刺激聲。實驗中以能分辨出ABR I 波的最低刺激強度作為ABR 閥值，ABR 檢測3 次，取平均值[2]。（2）K+轉運蛋白抑制劑處理。布美他尼處理組10 只小鼠于藥物處理前行ABR 檢測，予以腹腔內注射麻醉后，給予NKCC1 抑制劑布美他尼注射，注射30 min 后再予以ABR 檢測；停藥3 d，后再次行ABR 檢測。呋塞米處理組10 例小鼠于藥物處理前行ABR 檢測，予以腹腔內注射麻醉后給予NKCC1 抑制劑呋塞米注射，注射30 min 后再予以ABR 檢測；停藥3 d，后再次行ABR 檢測。

1.3 觀察指標

1.3.1 健康對照組、布美他尼處理組、呋塞米處理組小鼠ABR 閥值比較 根據檢測結果，對比分析健康對照組、布美他尼處理組、呋塞米處理組小鼠ABR 閥值。

1.3.2 布美他尼處理組、呋塞米處理組小鼠給藥前后及恢復后ABR 閥值比較 根據檢測結果，對比分析布美他尼處理組、呋塞米處理組小鼠給藥前后及恢復后ABR 閥值。

1.4 統計學方法 數據處理采用SPSS20.0 統計學軟件。計量資料用表示，采用t 檢驗。多組間數據的簡單比較用方差分析。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組小鼠ABR 閥值比較 給藥前三組平均ABR 閥值比較，差異無統計學意義（t=2.103，P=0.925）；給藥后，布美他尼處理組、呋塞米處理組平均ABR 閥值均高于健康對照組（t=7.142、8.261，P=0.041、0.039），且布美他尼處理組平均ABR 閥值高于呋塞米處理組（t=7.563，P=0.040）。見表1。

表1 三組小鼠ABR 閥值比較（dB SPL

表1 三組小鼠ABR 閥值比較（dB SPL

組別 n 給藥前 給藥后健康對照組1022.34±4.25-布美他尼處理組1023.45±5.2165.20±10.41呋塞米處理組1023.14±5.3250.35±8.56

2.2 布美他尼處理組、呋塞米處理組小鼠給藥前后及恢復后ABR 閥值比較 停止給藥恢復后，布美他尼處理組、呋塞米處理組平均ABR 閥值均低于給藥后（t=8.284、8.556，P=0.037、0.036），與給藥前接近。見表2。

表2 布美他尼、呋塞米處理組給藥前后及恢復后ABR 閥值比較（dB SPL

表2 布美他尼、呋塞米處理組給藥前后及恢復后ABR 閥值比較（dB SPL

組別 n 給藥前 給藥后 停止給藥恢復后布美他尼處理組1023.45±5.2165.20±10.4127.45±6.26呋塞米處理組1023.14±5.3250.35±8.5625.15±5.54

3 討論

NKCC1 是Na+-K+-Cl-內向共轉運體（Na、K 濃度梯度共同驅動），與K+-Cl-外向共轉運體（鉀濃度梯度驅動）同屬于氯偶聯的共轉運體家族，市面上針對NKCC 靶點的藥物開發主要集中在心腦血管疾病治療領域，包括高血壓、水腫以及心力衰竭等[3]。近年來，隨著臨床醫學及動物實驗對耳聾疾病病理機制研究的不斷深入，諸多文獻研究報道強調NKCC1 蛋白的低表達在聽覺功能損傷中發揮了重要的作用[4]。臨床上，關于NKCC1 在聽覺功能中的作用尚無確切結論，但國內外一致持有如下觀點：NKCC1 可通過對內向性Na+濃度梯度的利用以1 Na+:1K+:2Cl-的比例將離子轉運至邊緣細胞，而經邊緣細胞頂膜上的KCNQ1 通道將K+分泌至淋巴，進而形成EP；同時分泌至耳蝸內淋巴中的K+經基底膜毛細胞與螺旋韌帶間的通道進行轉運，再次進入邊緣細胞，以此循環，構成耳蝸K+循環機制，進而對聽覺功能進行維持[5]。布美他尼/呋塞米兩類K+轉運蛋白抑制劑對NKCC1 蛋白的表達具有顯著的抑制作用，這兩類藥物所造成的聽力損傷是雙側對稱性，這主要是因為該兩類藥物與內耳毛細胞膜接觸，增加了內耳毛細胞的通透性，而袢利尿劑以較高的濃度進入到細胞內，引起了毛細胞的損傷。

褚漢啟等的研究中應用NKCC1 抑制劑呋塞米對CBA/CaJ 和Castel 兩種鼠系進行了離子轉運蛋白抑制-聽覺實驗，并對小鼠ABR 閾值進行檢測，結果顯示小鼠經呋塞米注射30 min 后，ABR 閾值顯著高于注射前（P＜0.01），且顯著高于正常對照組（P＜0.01），提示呋塞米對NKCC1 具有顯著的抑制作用，會對小鼠聽覺功能造成影響，這與本次研究結果一致[6]。王橋生等按隨機數字法將SD 大鼠分成假手術組、腦缺血組和布美他尼組，結果顯示大鼠予布美他尼干預后，NKCC1 表達均顯著下降（P＜0.05），證實布美他尼可通過下調NKCC1 表達水平改善缺血性腦水腫和神經功能[7]。而目前尚無關于布美他尼/呋塞米兩類K+轉運蛋白抑制劑對小鼠聽覺功能及NKCC1 抑制作用的對比研究文獻報道。本研究采用對照研究的方法，分別對健康對照組、布美他尼處理組、呋塞米處理組小鼠的ABR 進行檢測，結果給藥后，布美他尼處理組、呋塞米處理組平均ABR 閥值均高于健康對照組（P＜0.05），即經布美他尼、呋塞米兩類K+轉運蛋白抑制劑處理后，小鼠聽覺功能明顯損傷。經藥物處理后，布美他尼處理組平均ABR 閥值高于呋塞米處理組（P＜0.05），停止給藥恢復后，布美他尼處理組、呋塞米處理組平均ABR 閥值均低于給藥后（P＜0.05），與給藥前接近，提示布美他尼對NKCC1 的抑制作用高于呋塞米，對小鼠聽覺功能的損傷影響高于呋塞米。

綜上所述，布美他尼K+轉運蛋白抑制劑對NKCC1 的抑制作用高于呋塞米，對小鼠聽覺功能的損傷影響高于呋塞米。