大承氣湯對(duì)腸源性膿毒血癥大鼠免疫功能的影響

1.湖南中醫(yī)藥高等專科學(xué)校基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部,湖南 株洲 412012；2.湖南中醫(yī)藥高等專科學(xué)校附屬第一醫(yī)院，湖南 株洲 412000

大承氣湯由大黃、芒硝、厚樸和枳實(shí)4味中藥組成，方中大黃為君藥，行瀉熱通便之效；芒硝為臣藥，行瀉熱軟堅(jiān)潤(rùn)燥之效，助大黃通腑實(shí)積滯；枳實(shí)、厚樸共為佐使藥，有行氣散結(jié)，消痞除滿之效，共助大黃、芒硝蕩滌腸中積滯。全方用藥雖少，但其峻下熱結(jié)功效顯著，主治陽(yáng)明腑實(shí)證、熱結(jié)旁流以及里熱實(shí)證之熱厥、痙病或發(fā)狂等。中醫(yī)學(xué)中并無(wú)膿毒血癥之謂，但究其臨床特點(diǎn)，其病機(jī)主要是熱毒積阻，氣血瘀滯，治宜清熱解毒，通腑利氣，活血化瘀。因此，大承氣湯對(duì)膿毒血癥有比較好的治療價(jià)值[1-2]，并進(jìn)行了相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究。

膿毒血癥是一種由感染引起的全身性炎癥反應(yīng)，且伴隨感染出現(xiàn)的器官功能性損害的臨床綜合征[3-4]。膿毒血癥發(fā)生過(guò)程中，炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)啟動(dòng)，刺激誘發(fā)細(xì)胞因子風(fēng)暴，多種促炎性細(xì)胞因子和抑炎細(xì)胞因子被激活，大量淋巴細(xì)胞被誘導(dǎo)凋亡，導(dǎo)致機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)機(jī)能紊亂，甚至被抑制[5-6]。在膿毒血癥病理過(guò)程中，免疫細(xì)胞過(guò)度激活和淋巴細(xì)胞受抑制的持續(xù)存在，會(huì)導(dǎo)致機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)機(jī)能和淋巴細(xì)胞的分泌和增殖功能受到抑制，持續(xù)造成組織和器官損傷[7]。本次實(shí)驗(yàn)旨在探討大承氣湯對(duì)膿毒血癥大鼠的免疫功能影響作用，探討和分析其內(nèi)在的機(jī)理。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠，雌雄各半，體重180～220 g，購(gòu)自湖南斯萊達(dá)景克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(許可證號(hào)：SCXK(湘) 2014-0003)。

1.2 藥物 大承氣湯藥物按大黃：厚樸：枳實(shí)：芒硝體質(zhì)量比4∶5∶5∶3組成。藥材用蒸餾水清洗3次，再蒸餾水中浸泡30 min，武火將厚樸、枳實(shí)武火煮沸20 min后，改用文火煎煮10 min，再加入大黃續(xù)煎10 min后澄取煎液，頭煎和復(fù)煎液混勻，芒硝倒入，充分融化，用四層無(wú)菌紗布過(guò)濾，55 ℃水浴濃縮至含生藥1.0 g/mL，置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩４姿釢娔崴善瑖?guó)藥準(zhǔn)字H33021207，批號(hào):150117，浙江仙琚制藥股份有限公司生產(chǎn)。

1.3 儀器和試劑 GHP-9160隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒公司生產(chǎn))，分析天平(湖南湘儀公司)，臺(tái)式變頻TGL16M型高速冷凍離心機(jī)(長(zhǎng)沙科威實(shí)業(yè)有限公司)，ELISA 酶標(biāo)儀(Thermo公司)，IgA、IgG、IgM ELISA試劑盒(上海研謹(jǐn)生物科技有限公司)。

2 方法

2.1 腸源性膿毒癥模型制備[8]參照經(jīng)典的盲腸結(jié)扎穿刺法(ceca ligation and puncture，CLP)復(fù)制動(dòng)物模型，2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠后，大鼠板固定，手術(shù)常規(guī)消毒后，沿腹中線切開(kāi)，在盲腸遠(yuǎn)端結(jié)扎盲腸，18G針頭在結(jié)扎處遠(yuǎn)端垂直于盲腸對(duì)穿盲腸2次，輕輕擠出腸內(nèi)容物，復(fù)位，然后縫合。假手術(shù)組動(dòng)物打開(kāi)腹腔后，不結(jié)扎不對(duì)穿，鈍性攪動(dòng)盲腸后縫合，不做其他處理。

2.2 動(dòng)物分組及干預(yù)措施 模型動(dòng)物按體重隨機(jī)分為模型組、大承氣湯5 g/kg組、大承氣湯10 g/kg組和激素組，另設(shè)正常組和假手術(shù)組，每組動(dòng)物10只。動(dòng)物給藥劑量按照體表面積折算法進(jìn)行，其中正常組、模型組和假手術(shù)組動(dòng)物生理鹽水灌胃，大承氣湯5 /kg組、大承氣湯10 g/kg組、激素組0.5 mg/kg分別灌胃對(duì)應(yīng)藥物，所有動(dòng)物給藥體積為10 mL/kg，連續(xù)7 d。

2.3 樣本取材和觀察指標(biāo) 最后一次灌胃給藥結(jié)束后8 h，腹主動(dòng)脈取大鼠外周血，低速冷凍離心分離血清，-70 ℃冰箱凍存?zhèn)錂z測(cè)各組動(dòng)物血清IgA、IgG、IgM水平(ELISA法)；解剖大鼠，分離大鼠脾臟和胸腺，無(wú)菌生理鹽水沖洗干凈，分析天平稱重，分別計(jì)算脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，其中脾臟(胸腺)指數(shù)=脾臟(胸腺)重量(g)/體重(kg)。

3 結(jié)果

3.1 大承氣湯對(duì)膿毒癥大鼠胸腺和脾臟指數(shù)的影響 從表1可知，模型組胸腺指數(shù)和脾指數(shù)顯著低于正常組和假手術(shù)組，說(shuō)明膿毒血癥大鼠對(duì)免疫器官受到顯著的抑制作用(P< 0.01)；但在大承氣湯治療7 d后，膿毒血癥大鼠的胸腺指數(shù)和脾指數(shù)得到一定提高，和模型組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)；與激素組相比，大承氣湯10 g/kg組胸腺指數(shù)和脾指數(shù)有一定程度提高(P<0.05)。結(jié)果表明大承氣湯可以保護(hù)膿毒血癥中免疫器官，對(duì)機(jī)體的正常免疫應(yīng)答有正向調(diào)節(jié)作用。

組別n胸腺指數(shù)脾臟指數(shù)正常組102.026±0.182??5.492±0.428??模型組100.907±0.0922.617±0.119假手術(shù)組101.752±0.137??4.638±0.354??大承氣湯5g/kg組101.523±0.186?4.296±0.385?大承氣湯10g/kg組101.948±0.160??△5.081±0.407??△激素組101.605±0.142?4.335±0.373?

注：與模型組相比，*P<0.05，* *P<0.01；與激素組相比，△P<0.05，△△P<0.01。

3.2 大承氣湯對(duì)膿毒癥大鼠血清IgA、IgG、IgM水平的影響 正常組與模型組比較，模型組 IgG、IgA、IgM 含量顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示模型動(dòng)物體內(nèi)炎性因子大量釋放，導(dǎo)致外周血清中免疫細(xì)胞數(shù)目顯著減少；大承氣湯干預(yù)治療后，血清IgA、IgG、IgM水平能明顯的回升(P<0.01或P<0.05)，說(shuō)明大承氣湯能促進(jìn)機(jī)體的主動(dòng)免疫反應(yīng)；與激素組相比，大承氣湯10 g/kg組也明顯具有優(yōu)勢(shì)(P<0.05)。見(jiàn)表2。

組別nIgAIgGIgM正常組100.284±0.023??1.587±0.046??0.507±0.026??模型組100.129±0.0141.034±0.0370.204±0.019假手術(shù)組100.246±0.018??1.352±0.026??0.468±0.026??大承氣湯5g/kg組100.197±0.016?1.226±0.028? 0.411±0. 028? 大承氣湯10g/kg組100.255±0.020??△1.441±0.030??△0.482±0.033??△激素組100.224±0.026?1.305±0.029?0.419±0.027?

注：與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01；與激素組相比，△P<0.05，△△P<0.01。

4 討論

在膿毒血癥病理過(guò)程中，促炎因子大量釋放的同時(shí)，也會(huì)激發(fā)大量抑炎因子被釋放，導(dǎo)致患者的正常免疫功能受到抑制[9-10]。在CLP復(fù)制膿毒血癥小鼠中，Hotchkiss等[11]研究發(fā)現(xiàn)動(dòng)物體內(nèi)存在淋巴細(xì)胞凋亡，原發(fā)性低免疫反應(yīng)和T淋巴細(xì)胞免疫功能抑制。當(dāng)膿毒血癥患者進(jìn)入免疫抑制階段，過(guò)渡活化淋巴細(xì)胞會(huì)發(fā)生大概率凋亡，其增殖能力受到顯著抑制，導(dǎo)致機(jī)體自身免疫保護(hù)能力降低[12]。

藥理研究證實(shí)[13-14]，大承氣湯有攻下瀉熱逐瘀之效，其能降低腸粘膜和腸細(xì)胞膜通透性，減輕腸粘膜組織炎癥病理?yè)p傷，減少血清內(nèi)毒素和炎性細(xì)胞因子的釋放。另外，大承氣湯能雙向調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞免疫功能，其適當(dāng)劑量能促進(jìn)正常巨噬細(xì)胞釋放TNF-α，TNF-α可進(jìn)而作用于并激活T、B淋巴細(xì)胞，最終增強(qiáng)T、B淋巴細(xì)胞免疫功能[15]。胸腺和脾臟是機(jī)體重要的免疫器官，其體質(zhì)量是反映免疫器官功能的重要指標(biāo)，因此選用胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)本實(shí)驗(yàn)研究中膿毒血癥大鼠的免疫水平。研究結(jié)果表明：大承氣湯可明顯提高模型動(dòng)物的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)(P<0.01或P<0.05)，且呈現(xiàn)一定的劑量正相關(guān)性，可見(jiàn)大承氣湯可對(duì)抗膿毒血癥大鼠胸腺和脾臟萎縮，提高機(jī)體免疫能力。存在于血液、體液、組織液中的免疫球蛋白，是機(jī)體具有抗體活性的蛋白，可發(fā)揮抗感染免疫功能。血清中IgA、IgG、IgM水平的變化，能提示膿毒血癥病變進(jìn)程和治療效果。實(shí)驗(yàn)中，膿毒血癥大鼠血清IgA、IgG、IgM水平較正常組顯著降低(P<0.01)，提示其免疫反應(yīng)受到抑制，機(jī)體免疫反應(yīng)低下。大承氣湯可有效提高血清IgA、IgG、IgM水平(P<0.01或P<0.05)，說(shuō)明其可有效調(diào)節(jié)漿細(xì)胞分泌球蛋白，參與機(jī)體體液免疫反應(yīng)，提高機(jī)體免疫能力，從而減緩器官和組織免受損傷。綜合來(lái)看，大承氣湯可有效調(diào)節(jié)膿毒血癥中抗炎與抑炎失衡所導(dǎo)致的免疫功能紊亂，來(lái)發(fā)揮其治療作用，機(jī)理值得進(jìn)一步深入探討。