陰地蕨不同采收期木犀草素含量的動態積累研究

1.湘潭醫衛職業技術學院, 湖南 湘潭 411102 ； 2.南方醫科大學，廣東 廣州 510515

陰地蕨為陰地蕨科植物陰地蕨Botrychiumternatum(Thunb.)Sw.的全草。廣泛分布于云南、貴州、湖北、湖南、廣西等地，《中華本草》[1]和《中藥大辭典》中均有收錄[2]。傳統中醫認為陰地蕨味甘、苦，性微寒，具有清熱解毒，平肝熄風，明目去翳之功效。臨床常用于小兒高熱驚搐，肺熱咳嗽，目赤翳障等癥的治療。現代藥理學實驗證實，陰地蕨中的木犀草素具有多種藥理活性：抗炎、抗過敏、鎮咳、抗纖維化、抑制腫瘤細胞增殖等作用[3～5]。

隨著最近幾年國家的 “精準扶貧”政策，廣大山區種植中藥材業已成為不少農村脫貧致富的好途徑，陰地蕨作為云貴地區的民族藥，分布十分廣泛，具有較大的研究和開發意義。但作為人工種植的陰地蕨藥材，目前國內尚無統一的質量標準。為了更好地開發利用這一藥材資源，筆者對其中木犀草素含量的動態積累規律進行了研究。

1 儀器和試劑

1.1 儀器 UV-2201型紫外分光光度計(日本島津儀器公司)，LC-20A T高效液相色譜儀(日本島津儀器公司，SPD-20A型紫外檢測器，CTO-10AS vp型柱溫箱，CBM-102型工作站)，SY25-1200型超聲波清洗器(張家港市三友超音設備有限公司)，0.45 μm微孔濾膜(天津津騰實驗設備有限公司)，高速萬能粉碎機(長沙旭眾機械設備有限公司)。

1.2 藥材 研究所用陰地蕨樣品分別在國內3個省區(云南省昆明市西山區，貴州省銅仁市萬山區，湖南省益陽市安化縣)收集，共24份，經湖南中醫藥大學劉塔斯教授鑒定，所采集樣品均為陰地蕨科(Botrychiaceae)植物陰地蕨(Botrychium ternatum)的全株。2018年6月至2019年9月采收陰地蕨全株，洗凈，曬干。

1.3 試劑 木犀草素對照品(中國食品藥品檢驗研究院，批號：111520-201605)，乙腈(天津市科密歐化學試劑有限公司，批號：20170615)、甲醇(天津市科密歐化學試劑有限公司，批號：20170814)、異丙醇(天津四友精細化學品有限公司，批號：20170513)為色譜純，實驗研究所用其它試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液制備 取木犀草素對照品0. 50 mg，精密稱量，置于5 mL的容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2 陰地蕨供試品溶液制備 取陰地蕨樣品粉末(過三號篩)1.0 g，精密稱定，將藥材粉末置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，超聲(功率500W，頻率40kHz)處理45 min，放冷，再次稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得[6-7]。

2.3 色譜條件及適應性試驗 色譜柱為菲羅門ODS(150 mm×4.6 mm，4 μm)；流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液(45∶55)；流速1 mL·min-1；柱溫為30 ℃；檢測波長為350 nm。在此條件下，理論板數按木犀草素峰計算應不低于5000。

2.4 測定法 分別精密吸取木犀草素對照品溶液與陰地蕨供試品溶液各20 μL，注入液相色譜，測定，即得，結果見圖1、圖2。

2.5 線性關系考察 分別從0.104 mg·mL-1的標準溶液中吸取5、10、15、20、25 μL，作HPLC分析。以峰面積(Y)為縱坐標，木犀草素對照品含量(X)為橫坐標，繪制標準曲線。數據經回歸處理，得木犀草素的線性方程為：Y=2175628X+2104，r=0.9998，表明木犀草素的進樣量在0.251～2.004 μg范圍內時線性良好。

2.6 精密度試驗 取木犀草素對照品溶液，連續進樣6次，測得各次峰面積，并計算相對標準偏差(RSD)值，結果見表1。

2.7 穩定性試驗 取陰地蕨藥材藥材粉末1 g，精密稱定，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按 “2.3”項下色譜條件分別于0、4、8、12、16、20、24h依次注入高效液相色譜儀，進行HPLC分析，測得每個時間點木犀草素的峰面積，并計算其RSD(%)值，結果見表2。

表1 對照品精密度試驗

表2 樣品穩定性試驗

2.8 重復性試驗 取陰地蕨藥材1 g，精密稱定，按照“2.2項 陰地蕨供試品溶液制備”的方法，平行制備樣品溶液6份，分別進樣20 μL，進行HPLC分析，測定樣品含量，并其計算RSD值，結果見表3。

表3 樣品重復性試驗

2.9 加樣回收率試驗 取已知含量的陰地蕨藥材樣品粉末6份，各約0.5 g，精密稱定。分別精密加入濃度為0.104 mg·mL-1的木犀草素對照品溶液1.5 mL，按 “2. 2”項下方法制備供試品溶液，進樣20 μL，按 “2. 3”項下色譜條件進行測定，計算回收率。結果見表4。

2.10 樣品測定 取不同產地、不同采收期、不同部位(根、莖、葉)的陰地蕨藥材適量，精密稱定，按供試品溶液制備(2.2)項下制備樣品溶液。取樣品溶液和木犀草素對照品溶液各20 μL，注入高效液相色譜儀，測定，計算木犀草素的含量，結果見表5。

表4 木犀草素的加樣回收率試驗

表5 不同產地、不同采收期、不用部位陰地蕨藥材中木犀草素的含量

3 結論

經查閱相關文獻可知[8-9]：陰地蕨木犀草素易溶于甲醇，故在實驗中選擇甲醇作為提取溶劑。在實驗中先后考察了回流提取法與超聲提取法，通過HPLC分析對比，發現上述兩種提取方法所得的陰地蕨藥材中木犀草素含量相似。但超聲提取法更快捷、方便, 故選用超聲提取法對陰地蕨藥材樣品進行處理。同時，在實驗中還對流動相的比例(體積)進行了充分的考察，選用甲醇-乙腈-水(20∶40∶40)、乙腈-水(42∶58)、甲醇-醋酸-水(60∶0.1∶39)等作流動相，木犀草素的分離度和理論塔板數均達不到要求。經過多次、反復摸索實驗條件，發現采用乙腈-0.1%磷酸水溶液(45∶55)為流動相，木犀草素可以與相鄰成分達到基線分離，峰形較好，基線平穩，符合要求[10-11]。

分別對不同產地、不同采收期、不同藥用部位陰地蕨中木犀草素的含量進行了測定。實驗結果表明：不同產地的陰地蕨藥材在同一采收期木犀草素的含量無明顯差異；不同部位陰地蕨藥材中木犀草素的含量差別很大，即葉>莖>根；不同產地陰地蕨藥材中木犀草素的含量呈規律性變化，其中6月初到7月中旬木犀草素的含量呈上升趨勢，7月下旬到8月上中旬含量較高，隨后逐漸下降。故建議陰地蕨的根不作為入藥部位，以地上部分作為入藥部位，每年8月份為陰地蕨藥材的最佳采收期。