8個(gè)廠家74批次丹參片中脂溶性成分丹參酮ⅡA的含量比較研究

秦學(xué)玲1 蔣新平2 馬 娜1 楊璐璐3 秦興衛(wèi)4

1.云南省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，云南 昆明 650011；2.云南百康藥業(yè)有限公司，云南 昆明 650106； 3.中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九二〇醫(yī)院，云南 昆明 650032；4.昆明賽諾制藥股份有限公司，云南 昆明 650011

丹參片是《中國(guó)藥典)一部收載的品種，具有活血化瘀的作用, 用于瘀血閉阻所致的胸痹，癥見(jiàn)胸部疼痛、痛處固定、舌質(zhì)紫暗；冠心病心絞痛見(jiàn)上述證候者[1-5]。軍事訓(xùn)練傷急性損傷后期或軟組織慢性損傷，有瘀斑或瘀血并伴腫痛，口服丹參片有活血化瘀及緩解腫痛的作用。研究表明，丹參中的活性成分主要有脂溶性的丹參酮類和水溶性的酚酸類成分[6-14]。丹參片在中國(guó)藥典2015年版一部中的含量測(cè)定項(xiàng)為HPLC法測(cè)定丹參中丹酚酸B的含量，而丹參片的另一類主要成分即脂溶性成分未作相應(yīng)的含量測(cè)定控制[1]。而且臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，不同廠家生產(chǎn)的丹參片質(zhì)量和療效存在很大差異，為此，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用HPLC法對(duì)本次國(guó)家評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)的8個(gè)不同廠家74批次丹參片樣品，在檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm下對(duì)脂溶性成分丹參酮ⅡA的含量進(jìn)行了測(cè)定研究。通過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證，該方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，為丹參片的整體質(zhì)量控制監(jiān)管提供科學(xué)依據(jù)；并采用頻數(shù)分布圖和箱形圖對(duì)其含量進(jìn)行比較分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

高效液相色譜(HPLC)島津LC20AT系統(tǒng)；天平：Mettler AE240電子天平(瑞士梅特勒公司)；對(duì)照品丹參酮ⅡA(批號(hào)：110766-201520標(biāo)示量為98.9%)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜級(jí)(美國(guó)Merck公司)，水為重蒸水(自制)，其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；丹參片為2015年國(guó)家評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)抽取的樣品。

2 溶液制備

2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取丹參酮ⅡA對(duì)照品22.36 mg，置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，再精密量取1 mL，置100 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成每1 mL含22.11 μg的溶液，即得。

2.2 供試品溶液 取本品10片，糖衣片除去糖衣，研細(xì)，取約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇溶液50 mL，稱定重量，超聲處理30 min(功率：280 w；頻率：40 kHz)，放冷至室溫，再稱定重量，用甲醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.3 陰性樣品溶液 取缺丹參的丹參片陰性樣品，按“2.2”項(xiàng)下的方法，制得陰性樣品溶液，即得。

3 方法與結(jié)果

3.1 色譜條件 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱：Aglient C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱；流動(dòng)相：甲醇-水(75∶25); 柱溫30 ℃;流速為1 mL·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm。進(jìn)樣量：10 μL。在此色譜條件下，丹參酮ⅡA對(duì)照品，樣品和缺丹參的陰性樣品的分離色譜圖如圖1所示。

3.2 線性關(guān)系考察 分別精密量取2.1項(xiàng)下配制的對(duì)照品溶液 1 mL、1 mL、1 mL、2 mL、3 mL、20 mL至25 mL、10 mL、5 mL、5 mL、5 mL、25 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，得線性關(guān)系各濃度對(duì)照品溶液。精密吸取上述各濃度對(duì)照品溶液10 μL，注入液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(x)，峰面積為縱坐標(biāo)(y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到丹參酮ⅡA的回歸方程為：y=3813.8x+36.125(R2=1.0000)線性范圍為0.00885～0.221 μg。結(jié)果表明線性關(guān)系良好。

3.3 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液③，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10 μL，測(cè)定峰面積值，結(jié)果丹參酮ⅡA峰面積的RSD為0.01%。表明儀器精密度良好。

3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液分別于0、2、4、12、16和24 h進(jìn)樣10 μL進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果丹參酮ⅡA峰面積的RSD為0.01%。表明供試品溶液中的待測(cè)成分丹參酮ⅡA在室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批丹參片樣品(批號(hào):150305)，按“2.2”項(xiàng)下的方法平行制得6份供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣10 μL進(jìn)行測(cè)定并計(jì)算，結(jié)果平均含量值為1.037 mg·g-1,RSD為和0.02%。表明其重復(fù)性良好。

3.6 回收率試驗(yàn) 取丹參片樣品(批號(hào):150305)適量，精密稱取6份，每份約0.5 g， 置具塞錐形瓶中，精密加入丹參酮ⅡA對(duì)照品溶液⑦ (質(zhì)量濃度為176.91 μg·mL-1)3 mL，再精密加入甲醇溶液50 mL，按“2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，進(jìn)樣10 μL進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果丹參酮ⅡA平均回收率(n=6)為99.6%，RSD為0.02%。表明該方法的回收率良好。

3.7 樣品的測(cè)定 取8個(gè)廠家74批次丹參片樣品，按“2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣10 μL進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表1和圖2。

表1 74批次丹參片中丹參酮ⅡA的含量測(cè)定結(jié)果 (mg·片-1)

3.8 結(jié)果 由表1和圖2可以看出，8個(gè)廠家74批次丹參片中丹參酮ⅡA含量變化幅度較大，批間差異明顯，最高含量為每片0.6533 mg，最低含量為每片0.0484 mg，最高者為最低者的13.5倍； B企業(yè)和F企業(yè)樣品中丹參酮ⅡA含量明顯高于其他企業(yè)；D企業(yè)和H企業(yè)樣品中丹參酮ⅡA含量居中；A企業(yè)、C企業(yè)E企業(yè)和G企業(yè)樣品中丹參酮ⅡA含量明顯偏低；其中D和H企業(yè)存在明顯的批間差異。

4 討論

4.1 提取溶劑的選擇 分別以甲醇、體積分?jǐn)?shù)為50%甲醇、70%甲醇和90%甲醇超聲提取30 min。結(jié)果以甲醇提取效率最高，故選擇甲醇為提取溶劑。

4.2 提取方法的選擇 以甲醇為提取溶劑，分別進(jìn)行超聲15、30和60 min及加熱回流0.5、1和2 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，超聲提取與加熱回流提取效果相當(dāng)，超聲30 min與60 min效果相當(dāng)，故提取方法確定為超聲提取30 min。

4.3 流動(dòng)相種類的選擇 分別以①甲醇-體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸；②甲醇-體積分?jǐn)?shù)為0.1%的磷酸；③乙腈-體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸；④乙腈-體積分?jǐn)?shù)為0.1%的磷酸；⑤甲醇-水；⑥乙腈-水對(duì)供試品溶液進(jìn)行了含量測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用甲醇-水作流動(dòng)相效果最佳。

4.4 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 我們參考相關(guān)文獻(xiàn)和中國(guó)藥典，選用λ=270 nm作為丹參酮ⅡA含量測(cè)定的檢測(cè)波長(zhǎng)。