正交試驗優選鼻舒寧溫敏凝膠提取工藝

原 泉 李傳勛2 呂 佳* 周藝璇

1.遼寧中醫藥大學，遼寧 大連 116600；2.大連醫科大學藥理教研室，遼寧 大連 116044

過敏性鼻炎(lergic rhinitis，AR)屬中醫鼻鼽范疇，主要癥狀有鼻癢、鼻塞、打噴嚏、流鼻涕等，是一種常見的多發性鼻病[1]。過敏性鼻炎病因分為外因與內因。外因多為氣候變化、環境污染、風寒及火熱之邪內侵[2]。內因則多責之于肺脾腎三臟功能失調。過敏性鼻炎雖然不會給患者帶來嚴重的健康和生命安全威脅，但是卻會導致患者出現情緒失調、疲勞、食欲減退、注意力減退、睡眠紊亂以及學習障礙等問題，降低患者生活質量，所以必須重視過敏性鼻炎的臨床治[3]。

鼻用溫敏凝膠(nasal thermosensitive in situ ge1)是指以溶液狀態制備和給藥，在用藥部位因溫度變化刺激而發生相轉變，形成凝膠化半固體的制劑，獨特的溶液—凝膠轉變性質兼有制備簡單、使用方便，可延長藥物在鼻腔內的滯留時間等優點[4]。泊洛沙姆(poloxamer)是目前研究較為深入的一類溫敏型高分子凝膠材料，具有良好的生物相容性[5]。此次實驗根據鼻腔的生理特點，制備鼻舒寧溫敏型原位凝膠，以期延長藥物在鼻黏膜上的滯留時間，從而提高藥物的生物利用度。

中醫外治法不但能夠有效控制過敏性鼻炎的癥狀，而且還可以有效降低復發率。鼻舒寧溫敏凝膠由麻黃、白芷、皂角等八味中藥組成，臨床上治療過敏性鼻炎有良好的療效。本試驗以鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿提取量為考察指標, 通過正交試驗, 優選鼻舒寧凝膠提取工藝條件, 為該制劑的制備工藝研究提供依據。

1 儀器與試藥

島津LC-2010HT高效液相色譜儀(包括四元泵、VWD檢測器，自動進樣器，lab solution 化學工作站)，日本島津有限公司；AE240型十萬分之一電子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司。

鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿對照品(批號：171241-201809、171237-201510)，中國食品藥品檢定研究院；乙腈色譜純，水為二次蒸餾水，其余所用試劑皆為分析純。

2 方法與結果

2.1 樣品測定方法

2.1.1 色譜條件 色譜柱：月旭Welch ultimate XB-C18(4.6 mm×150 mm, 5 μm)；流動相：乙腈-0.02 mol/mL磷酸二氫鉀溶液(每100 mL加入0.28 mL三乙胺，磷酸調節pH值到3) (5∶95 )；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：210 nm。

2.1.2 對照品溶液的制備 對照品儲備溶液制備：精密稱定鹽酸麻黃堿對照品0.01060 g，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。濃度為：0.1060 mg/mL。精密稱定鹽酸偽麻黃堿對照品0.00692 g，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。濃度為：0.0692 mg/mL。

對照品溶液制備：精密量取鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿對照品溶液各5 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。濃度分別為：鹽酸麻黃堿0.0530 mg/mL、鹽酸偽麻黃堿0.0346 mg/mL。

2.1.3 供試品溶液的制備 分別精密吸取各試驗項下提取液5 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.45 um微孔濾膜濾過，取續濾液,作為供試品溶液。

2.1.4 線性關系考察 依次吸取“2.1.2”項下制備好的混合對照品溶液1、5、10、15、20 μL，按“2.1.1”項下的色譜條件分別進樣，記錄其各自的峰面積。以鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的進樣量(μg)為橫坐標，各自的峰面積為縱坐標，繪制曲線，求得回歸方程分別為：Y=2215237X+8658.343，r=0.999925；Y=2313705X-5101.35，r=0.999978。結果表明，在鹽酸麻黃堿在0.0530～1.0600 μg，鹽酸偽麻黃堿在0.0346～0.6920 μg的范圍內進樣，進樣量與峰面積成良好的線性關系，如圖1所示。

2.1.5 含量測定 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各 10 μL,注入液相色譜儀,測定峰面積,以外標法計算含量。

2.2 提取工藝的考察

2.2.1 正交試驗因素與水平設計 方中麻黃為君藥，其中主要含有鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿[6-7]。采用正交試驗優化提取工藝，以方中君藥麻黃中所含鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿提取量為考察指標，對影響提取效果的提取次數、提取時間、溶媒用量因素進行考察，因素水平見表1。采用 L9(34)正交表安排試驗。

表1 因素與水平表

水平A B C 提取次數/次 提取時間/h溶媒用量/倍 110.56,4,4 221.08,6,6 331.510,8,8

2.2.2 正交試驗設計 提取液的制備：分別取處方量的麻黃、白芷、川芎等藥材，按正交試驗表安排試驗，進行提取，濾過，即得正交試驗提取液1～9號。按2.1.1項下色譜條件，分別測定鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿的含量，計算正交試驗提取液1～9號中指標成分的含量，記錄各份提取液體積。結果見表2、3。

表2 L9(34)試驗安排與結果

表3 方差分析

由方差分析可知，以鹽酸麻黃堿、偽麻黃堿總含量為指標時，提取次數(A)和提取時間(B)有顯著性差異。由直觀分析可知，提取次數(A)和提取時間(B)的2、3水平優于1而且兩者差異小，結合實際生產，確定最優提取工藝為A2B3C2,即加8、6倍量的水回流提取2次，每次1.5 h，麻黃堿、偽麻黃堿總轉移率高于80%。

2.2.3 驗證試驗 取同批復方藥材3份，分別按照最優提取工藝進行試驗，制得的樣品測定鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿含量。結果見表4。

表4 驗證試驗 (n=3)

2.3 陰性供試品溶液的制備 取處方中除麻黃外的其余藥味，按優選出的提取工藝提取，得到提取液，同供試品溶液的制備方法處理，制得陰性供試品溶液。

2.4 專屬性試驗 分別取對照品溶液、供試品溶液和陰性供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進行測定，并分別記錄色譜圖，結果顯示陰性供試品對該實驗無干擾，如圖2、圖3、圖4所示。

2.5 穩定性試驗 取供試品溶液適量，按“2.1.1”項下分別在0、2、6、8、12、24 h依次進樣10 μL，鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿峰面積的RSD分別為0.50%、0.76%(n=6)，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.6 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，按“2.1.1”項下連續進樣6次，記錄色譜圖，測定峰面積，RSD分別為0.27%、0.24%，表明儀器有良好的精密度。

2.7 重復性試驗 取同一批樣品6份，每份5 mL，按供試品溶液制備方法制備樣品，并依法測定計算含量及RSD，結果鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的RSD分別為0.71%、1.15%(n=6)。表明該法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗 精密量取已知含量的樣品2.5 mL，共6份，至10 mL量瓶中，依次加入鹽酸麻黃堿對照品溶液(0.0530 mg/mL)3 mL和鹽酸偽麻黃堿對照品溶液(0.0346 mg/mL)3 mL，按供試品制備方法制樣，按“2.1.1”項下進樣進行分析，計算回收率，結果得鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的平均回收率分別為101.94%和102.12%，RSD分別為1.31%和2.37%。

3 討論

3.1 測定目標成分的選擇 麻黃為方中君藥，麻黃中鹽酸麻黃堿及鹽酸偽麻黃堿的含量最高，研究表明，鹽酸偽麻黃堿可選擇性地收縮上呼吸道毛細血管，消除鼻咽部黏膜充血、腫脹、減輕鼻塞等癥狀。對麻黃等藥材的提取工藝中，往往只局限于以麻黃堿含量為指標進行工藝的優選，具有一定的局限性; 本實驗增加了偽麻黃堿的含量測定。本實驗以鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的含量之和為指標，優選最佳提取工藝。

3.2 方法考察 采用紫外分光光度法對其進行全波長掃描，確定210 nm處有最大吸收波長。查閱文獻[8-10]，確定HPLC法的液相條件為乙腈-0.02 mol/mL磷酸二氫鉀溶液，該方法能夠縮短鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的出峰時間。并考慮使用三乙胺防止峰拖尾。在紫外波長范圍內，磷酸的紫外吸收干擾比乙酸弱。在低吸收波長處，乙酸在220 nm左右有吸收，會干擾吸收峰，故選用磷酸調節PH值，優化峰型。

3.3 柱溫考察 分別考察柱溫為25 ℃、30 ℃、35 ℃等間隔的不同溫度對鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿色譜行為的影響，結果發現不同溫度對兩者的系統適應性考察參數及保留時間無明顯影響，故柱溫最終為30℃。

3.4 流速考察 分別選擇流速為0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.2 mL/min等流速對鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿色譜行為的影響，結果顯示不同流速對兩者的系統適應性參數和保留時間無明顯影響，故流速最終為1.0 mL/min。

3.5 提取參數的確定 因鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿均具有揮發性，故回流提取的溫度不宜過高。因此不將溫度梯度作為正交試驗的考察因素。前期試驗及文獻[11-13]查閱確定了提取的次數、時間、溶媒量水平。

實驗結果顯示，液相條件小的變動對指標成分的峰型，分離度，保留時間均影響較小，此色譜條件可靠，可用于日常含量測定。采用正交設計的方法優化出最佳的提取工藝為加8、6倍量的水提取2次，每次提取1.5 h，且驗證試驗證明回流方法的提取率大于80%。