血當歸總黃酮提取工藝優化及其體外抗氧化活性研究

1.大理州食品藥品檢驗所，云南 大理 671000；2.大理大學藥學與化學學院，云南 大理 671000

血當歸又名化血丹、花葉天、花蝴蝶、黃澤蘭、赤脛散、散血蓮、草見血等，是蓼科蓼屬植物赤脛散(PolygonumruncinatumBuch.-Ham.ex D.Don var. sinense Hemsl.)的根，主要分布于云南、貴州、四川等省[1]。白族民間應用非常廣泛，具有清熱解毒、補血調經、舒經活絡的功效，大理民間白醫用于治療婦女月經不調、閉經、干血癆及其心血管疾病等[2]。作為藥物在月經不調、跌打損傷、乳腺炎、癰癤腫毒等癥狀時充分發揮其活血舒筋、消腫止血之功效[3-4]。相關文獻報道蓼屬植物主要含有黃酮、鞣質、蒽醌、萜類等多種化學成分[5-7]，現代藥理學研究表明，血當歸的乙醇提取物的水溶液對志賀氏痢疾桿菌有明顯的抑制作用[8-9]，醇提液對豬油有較強的抗氧化能力[10]。目前未見報道關于血當歸總黃酮提取工藝及其體外抗氧化活性的研究。研究采用超聲法提取血當歸總黃酮，且以總黃酮的含量為指標，采用L9(33) 正交表進行試驗，確定最佳提取工藝參數，并進行驗證性試驗，同時以抗壞血酸作為陽性對照，對血當歸總黃酮的體外抗氧化性進行研究，為血當歸的進一步開發利用提供一定的科學理論依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器 UV2550型紫外可見分光光度計(日本島津公司)，XSE205DU型電子分析天平(梅特勒-托利多國際貿易(上海)有限公司)，WVC-D22H型數顯超聲波清洗器(DAI HAN Scientific Ultrasonic Cleaner)。

1.2 材料 實驗所用血當歸樣品于2018年11月采自云南省大理州巍山縣廟街鎮，經大理州食品藥品檢驗所楊懷鏡主任藥師鑒定為蓼科蓼屬植物血當歸(PolygonumruncinatumBuch.-Ham.ex D.Don var. sinense Hemsl.)。蘆丁對照品(批號：SA4BJ-QR，純度98.2%，東京化成工業)，DPPH(批號：FBYXL-DR，純度>97.0%，東京化工)，ABTS(批號：YS8111502，純度>98%，上海思域化工)，抗壞血酸(批號：20160317，純度≥99.7%，廣東光華科技)，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 對照品與供試品溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備 取蘆丁標準品適量，精密稱定，置50 mL量瓶中，加濃度為65%的乙醇溶液適量，超聲使蘆丁溶解完全，再用65%乙醇定容，搖勻，避光保存，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備 準確稱取樣品(過60目篩)約1.0 g，置具塞三角瓶中，加入0.1 g氫氧化鈣，混勻，再加入65%乙醇溶液25 mL，超聲提取45 min，抽濾，濾液用65%乙醇溶液定容至100 mL，避光保存。

2.2 方法學考察

2.2.1 線性關系 精密吸取蘆丁對照品溶液1、2、3、4、5、6、7 mL分別置于25 mL量瓶中，再加5%NaNO2溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加入10%Al(NO3)3溶液1mL，搖勻，放置6 min，再加入4%NaOH溶液10 mL，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，靜置15 min，同法做空白，于510 nm波長處測定吸光度[11]。以吸光度值為縱坐標，對應蘆丁含量(mg·mL-1)為橫坐標繪制標準曲線。回歸方程為Y=13.06X-0.0125，r= 0.9995。結果表明：蘆丁在0.008～0.054 mg·mL-1范圍內具線性關系良好。

2.2.2 精密度試驗 精密量取蘆丁對照品溶液3.0 mL，按“2.2.1”項下連續測定6次吸光度，RSD值為0.30%，表明儀器的精密度良好。

2.2.3 重復性試驗 準確稱取6份樣品，每份約1.0 g，按“2.1.2”項下制備供試品溶液，按“2.2.1”項下測定吸光度。總黃酮含量的RSD值為0.91%。表明該方法有良好的重復性。

2.2.4 穩定性試驗 精密量取供試品溶液1.0 mL，按“2.2.1”項下，分別在0、5、10、20、30、45、60 min測定吸光度，RSD值為0.15%，表明在60 min內，供試品溶液有良好的穩定性。

2.2.5 加樣回收試驗 分別精密稱取已知含量(90.05 mg·g-1)的樣品9份，每份0.5 g，按表1加入蘆丁對照品。按“2.1.2”項制備供試品溶液，取供試品溶液1.0 mL，置25 mL量瓶中，其余操作同“2.2.1”，測定總黃酮含量，計算回收率。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果 (n=9)

2.3 含量測定 按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，根據“2.2.1”項下測定吸光度，按下式計算血當歸總黃酮含量。

式中:C為樣品的濃度(mg·mL-1) ，V為提取液定容體積(mL) ，D為測定時定容的體積(mL) ，m為稱取的樣品量(g) ，B為測定量取的體積(mL)。

2.4 單因素試驗 選擇乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取時間(C) 進行單因素試驗。分別改變乙醇濃度(55%，60%，65%，70%，75% )，料液比(1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35g·mL-1)，提取時間(30、45、60、75、90 min) 制備樣品液，計算總黃酮含量，考察各因素對總黃酮含量的影響。

2.5 正交試驗 分別精密稱取樣品粉末9份，每份約1.0 g，選取乙醇濃度A(%)，料液比B(g·mL-1)，提取時間C(min)各3個水平進行L9(33) 正交試驗，以提取的總黃酮含量(mg·g-1)為評價指標，考察血當歸總黃酮的最佳提取工藝條件，正交試驗因素水平見表2。

表2 正交試驗因素水平

2.6 抗氧化活性測定 在最優工藝條件下獲得血當歸總黃酮，采用二倍稀釋法配制成 0.78、1.6、3.1、6.2、12.5、25、50、100、200、400、800 mg·L-1濃度梯度的樣品溶液備用。

2.6.1 DPPH·清除能力的測定 參照文獻[12-17]的方法略作優化，在10 mL比色管中依次加入0.5 mmol·L-1DPPH·乙醇溶液2 mL、無水乙醇2 mL和不同濃度的樣品溶液2 mL，混勻，避光室溫放置30 min后，定容至10 mL，用無水乙醇代替樣品液做空白對照組，以無水乙醇進行調零，在517 nm處分別測吸光度A0、A1、A2，重復3次實驗，陽性對照為抗壞血酸，抗壞血酸的濃度和樣品溶液濃度相同，同樣采用二倍稀釋法配制11組濃度梯度的抗壞血酸溶液。通過以下公式即可分別計算出樣品和抗壞血酸對DPPH·的清除率，并根據SPSS 19.0軟件計算出IC50值(即自由基清除率達到50%時樣品的濃度)。

式中：A0為空白對照組的吸光度，A1為加入樣品液所測得的吸光度，A2為用同體積無水乙醇代替DPPH·乙醇溶液所測得的吸光度。

2.6.2 ABTS+·清除能力的測定 參照文獻[15-17]的方法略做優化，ABTS+·儲備液：3.75 mmol·L-1過硫酸鉀溶液和7.5 mmol·L-1ABTS溶液按1∶1混合，避光室溫下反應17 h。ABTS+·工作液：量取20.0 mL儲備液用無水乙醇稀釋，在734nm波長下測定，使吸光度值達0.7±0.02，臨用新配。在10 mL比色管中依次精密加入ABTS+·工作液3.0 mL和樣品溶液1.0 mL，混勻，用蒸餾水代替樣品液做空白對照組，避光靜置顯色10 min后，以蒸餾水進行調零，在734 nm波長處，分別測定吸光值A0、A1、A2，重復3次。陽性對照為抗壞血酸，計算清除率和IC50。

式中：A0為空白對照組的吸光度，A1為加入樣品液所測得得吸光度，A2為用同體積蒸餾水代替ABTS+·工作液所測得的吸光度。

2.6.3 清除·OH能力的測定 參照文獻[18-19]的方法略作優化，在10 mL比色管中依次加入7.5 mmol·L-1FeSO4溶液1 mL、7.5 mmol·L-1水楊酸乙醇溶液1 mL、60 mmol·L-1H2O2溶液1 mL和不同濃度的樣品溶液1 mL，搖勻，在37 ℃水浴加熱30 min，再用蒸餾水定容至10 mL，用蒸餾水代替樣品液做空白對照組。以蒸餾水進行調零，在510 nm波長處，分別測吸光度值A0、A1、A2，重復3次，陽性對照為抗壞血酸，計算清除率和IC50。

式中：A0為空白對照組的吸光度，A1為加入樣品液所測得的吸光度，A2為用同體積蒸餾水代替H2O2溶液所測得的吸光度。

3 結果與分析

3.1 血當歸總黃酮提取單因素考察的結果

3.1.1 乙醇濃度對血當歸總黃酮含量的影響 由圖1可見，血當歸總黃酮含量隨乙醇濃度增大而增大，當乙醇濃度達到65%后，血當歸總黃酮含量增大趨勢緩慢，因此，確定血當歸總黃酮提取的最佳乙醇濃度為65%，正交試驗乙醇濃度因素的3個水平選擇60%、65%和70%。

3.1.2 料液比對血當歸總黃酮含量的影響 由圖2可知，當料液比在1∶10～1∶25g·mL-1時，總黃酮的含量隨料液比增大而增高，當料液比為1∶25g·mL-1時，總黃酮含量達到最高。而后，總黃酮含量隨著料液比的增大而減小，因此，確定血當歸總黃酮提取的最佳料液比為1∶25g·mL-1，正交試驗料液比因素的3個水平選擇1∶20、1∶25、1∶30 g·mL-1。

3.1.3 提取時間對血當歸總黃酮含量的影響 由圖3可知，血當歸總黃酮的含量隨提取時間的延長而增大，當提取時間為60 min后，隨著提取時間的延長，總黃酮含量沒有明顯增大。因此，確定血當歸總黃酮提取的最佳提取時間為60 min，正交試驗提取時間因素的3個水平選擇45、60、75 min。

3.2 血當歸總黃酮提取正交試驗結果 從表3可以看出，影響血當歸總黃酮含量的提取因素大小順序為B>C>A，即料液比>提取時間>乙醇濃度。再分析k值可知，血當歸總黃酮最佳提取工藝方案為∶ A2B3C1。即乙醇濃度65%、料液比 1∶30 g·mL-1、提取時間45 min。在此條件下黃酮含量達90.01 mg·g-1，結果表明所選工藝合理、可行，可用于血當歸總黃酮提取工藝。

表3 正交試驗及結果分析

3.3 最佳工藝驗證試驗 為了進一步驗證所選提取條件的準確和科學，按最佳提取工藝分別進行3次平行重復試驗，結果所得血當歸總黃酮平均含量為90.05 mg·g-1(RSD=0.59%，n=3)，驗證試驗結果表明該提取工藝合理，穩定，重現性好。

3.4 血當歸總黃酮對DPPH·清除能力的影響 由圖4可知，血當歸總黃酮和抗壞血酸對DPPH·的清除率隨其濃度的增大而增大，當濃度達到50 mg·L-1后，DPPH·的清除率趨于平緩直線。從血當歸總黃酮和抗壞血酸對DPPH·清除率的IC50值來看，其強弱順序為∶ 血當歸總黃酮( IC50= 11.62mg·L-1)>抗壞血酸( IC50= 15.80mg·L-1)。當濃度為0.78～25 mg·L-1范圍內，血當歸總黃酮對DPPH·的清除率優于抗壞血酸，說明血當歸總黃酮抗氧化活性優于抗壞血酸，具有良好的 DPPH·清除能力。

3.5 血當歸總黃酮對ABTS+·清除能力的影響 由圖5可知，血當歸總黃酮和抗壞血酸對ABTS+·的清除率隨其濃度的增大而增大，當濃度達12.5 mg·L-1時，血當歸總黃酮對ABTS+·清除率是同濃度抗壞血酸的2.1倍。當濃度達到25 mg·L-1后，ABTS+·的清除率就基本達到100%，從血當歸總黃酮和抗壞血酸對ABTS+·清除率的IC50值結果來看，其強弱順序為∶ 血當歸總黃酮(IC50=1.83 mg·L-1)>抗壞血酸(IC50=11.1 mg·L-1)，說明血當歸總黃酮抗氧化活性優于抗壞血酸，具有很好的ABTS+·清除能力。

3.6 血當歸總黃酮對·OH清除能力的影響 由圖6可知，血當歸總黃酮和抗壞血酸對·OH的清除率隨濃度的增大而增大，血當歸總黃酮和抗壞血酸對·OH清除率的IC50值分別為136.12mg·L-1和334.58mg·L-1，根據·OH清除曲線可以看出，高濃度的血當歸總黃酮對·OH有很強的清除能力。

4 討論

本研究通過提取方法(超聲法和回流法)的考察，發現超聲法提取總黃酮含量比回流法更高，可能加熱后導致黃酮分解，其含量有所偏低，超聲法具有提取時間短、條件溫和、效率高、無需加熱等優點，最終確定采用超聲法提取血當歸總黃酮。由于血當歸中鞣質等水溶性雜質比較多，對測定的總黃酮含量存在一定的干擾，在提取總黃酮時加入了氫氧化鈣，可使藥材中的鞣質等水溶性雜質生成鈣鹽而沉淀，不被溶出，達到純化黃酮類化合物的效果。通過波長掃描樣品和蘆丁對照品，發現樣品的最大吸收波長在507 nm，而蘆丁對照品的最大吸收波長在510 nm，存在一定差異，可能樣品中的總黃酮還有一定的雜質干擾，但通過測定發現，樣品在波長507 nm和510 nm處的吸光度相差很小，基本對測定結果沒有影響，最終確定測定波長為510 nm。為了找到提取總黃酮的最佳方法，以不同濃度乙醇為溶劑采用超聲法提取血當歸總黃酮，分別考察了各單因素(乙醇濃度、料液比、提取時間)對提取血當歸總黃酮含量的影響，并通過L9(33) 正交設計對提取工藝進行優化，得到各因素對總黃酮含量影響程度大小為∶ 料液比>提取時間>乙醇濃度，通過優化得到血當歸總黃酮最佳提取工藝為乙醇濃度65%，料液比1∶30 g·mL-1，提取時間45 min，總黃酮含量達90.05mg·g-1。此條件下得到的血當歸總黃酮清除DPPH·，ABTS+·和·OH的能力良好，其IC50值分別為11.62、1.83、136.12 mg·L-1，尤其對ABTS+·清除能力最優，表明血當歸總黃酮具有較強的體外抗氧化活性，并且血當歸藥材中總黃酮含量較高，具有很高的藥用價值，值得綜合開發應用。