FAM134B介導的內質網自噬對膿毒癥的影響

楊勇，高甜甜，吳狄凌，伍國寶，黃佳，李金秀

（中南大學湘雅二醫院 重癥醫學科，湖南 長沙 410011）

膿毒癥是全身性炎癥反應綜合征，是急危重患者嚴重的并發癥之一，其發生的主要因素包括大的手術，感染及嚴重燒傷等[1]。膿毒癥病程發展迅速，其發病率及病死率居高不下，是重癥醫學所面臨的一個巨大挑戰[2]。早期的研究顯示，膿毒癥的發生主要是由于過度炎癥反應從而導致體內炎癥反應失衡，大量炎癥介質如腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α），白細胞介素-6（Interleukin 6,IL-6）等釋放，導致組織及器官的損害[3-4]。隨著研究的進一步深入，發現膿毒癥的發病過程十分復雜，涉及機體炎癥、免疫和凝血功能障礙等多個方面，同時，其對細胞功能代謝的影響也越來越受到關注[5]。膿毒癥致死率較高，臨床表現缺乏特異性，近年來，其發病機制的研究具有一定的臨床參考價值，深入且全面了解膿毒癥的發病機制對臨床診斷治療及預后具有重要意義[6]。

內質網（endoplasmic reticulum,ER）是最大的細胞內膜系統，在蛋白質及脂質合成，離子穩態，細胞器之間通訊中發揮重要功能[7]。為滿足細胞在不同應激下的功能，內質網穩態的維持至關重要，其中自噬在這個過程中發揮重要作用[8-9]。2015年研究發現，在真核細胞中存在的某些特殊蛋白可以介導內質網選擇性程序性降解，其中FAM134B 作為內質網中的蛋白，可以通過與LC3 Ⅱ相互作用，幫助內質網碎裂，形成小的片段從而被自噬體包裹，并與溶酶體融合降解[10-11]。早期對FAM134B基因的研究中發現，其在感覺神經疾病患者中存在突變，FAM134B敲除小鼠同樣可以表現出這種感覺缺陷。在這些小鼠中，內質網在痛覺感知神經元細胞體中累積無法有序降解，導致內質網自噬受損[10-11]。現在越來越多的研究顯示，內質網自噬在很多疾病的發生發展中發揮重要的功能，本研究利用膿毒癥大鼠及細胞模型，探討內質網自噬在膿毒癥發病的中的功能及相關機制。通過檢測膿毒癥大鼠腦組織及相關細胞模型中內質網蛋白FAM134B表達及分布，自噬及凋亡相關蛋白的表達及細胞凋亡情況，進一步了解FAM134B 介導的內質網自噬在膿毒癥發生中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

雄性SD 大鼠，體重250～300 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，N2a 細胞系來源于ATCC（美國典型培養物保藏中心），LC3 抗體、Activated-Caspase-3 抗體、Caspase-3 抗體、LC3 抗體、Beclein1抗體及FAM134B 抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，β-actin 抗體、脂多糖（LPS）購自美國Sigma-Aldrich 公司，BSA 蛋白定量試劑盒、DMEM 培養基、胎牛血清（FBS）及胰蛋白酶購自美國Thermo Fisher Scientific 公司，引物購自寶生物工程（大連）有限公司，其他相關生化試劑為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 膿毒癥大鼠模型的復制 采用盲腸結扎穿孔術（CLP）方法誘發SD 大鼠膿毒癥，使用4 ml/kg 水合氯醛通過腹腔注射麻醉，打開腹腔，在離盲腸4 cm處結扎，CLP 6 h 后注射抗生素，同時觀察大鼠相關改變，確定為膿毒癥大鼠模型[12]。動物實驗完成于中南大學湘雅二醫院實驗動物中心[行政許可決定書文號：SYXK（湘）2017-0002]。

1.2.2 膿毒癥大鼠模型中腦部組織總RNA 及總蛋白的提取 SD 大鼠分為兩組，正常大鼠組（對照組）及CLP 誘發膿毒癥大鼠組（CLP組），每組8 只。在不同處理后，對大鼠進行麻醉和灌注固定，剝取鼠腦。將大鼠的頭部剪下，用剪刀剝取皮膚，再用鑷子和剪刀將大鼠腦外堅硬的外膜剝除，小心地取出完整的腦部，加入1 ml 的Trizol，勻漿研碎，室溫5 min。加入200 μl 氯仿，劇烈搖蕩離心管，4℃、11 600 r/min 離心10 min；轉移水相于一新EP 管，加0.7 倍體積異丙醇，4℃、11 600 r/min 離心10 min；棄上清液，加入1 ml 75%酒精，混勻，4℃、11 600 r/min 離心2 min，重復2 遍；棄上清，室溫干燥5 min，溶于DEPC 水中，測光密度（OD）值。同時取一部分腦部于勻漿器中，加入適量的蛋白酶抑制劑的SDS 裂解緩沖液中，冰上勻漿后靜置20 min，轉移至EP 管中，4℃、11 600 r/min離心5 min，取上清液即得到腦組織的總蛋白。

1.2.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測FAM134B mRNA 的表達 Trizol 法提取組織總RNA，紫外分光光度計進行定量檢測，逆轉錄合成cDNA，qRT-PCR 檢測FAM134B、β-actin mRNA 的Ct 值，擴增條件：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火34 s，40 個循環；做熔解曲線。以各基因Ct值與β-actin mRNA Ct 值的差值為△△Ct，計算各基因mRNA 的相對表達水平，并以正常組為參照做歸一處理，其他各組與其做比較。

1.2.4 N2a 細胞培養及處理 N2a 細胞培養于10% FBS 加DMEM 細胞培養基中，37℃、5%二氧化碳CO2，當細胞匯合度達到約80%時使用0.05%胰蛋白酶進行消化傳代。研究LPS 誘導膿毒癥細胞模型中內質網自噬及細胞凋亡實驗中，將細胞分為3組，分別為對照組、10 mg/L LPS 處理組及20 mg/L LPS 處理組；研究過表達FAM134B 對自噬及凋亡相關蛋白表達的影響實驗中，將細胞分為3組，分別為對照組、20 mg/L LPS 處理組及FAM134B 過表達+20 mg/L LPS處理組[FAM134B OE+ LPS（20 mg/L）組]。

1.2.5 Western blotting 檢測FAM134B、LC3、Beclin1及Caspase-3 蛋白相對表達 利用BSA 蛋白定量試劑盒進行定量，并不同樣品取等量的蛋白質（20 μg）；12% SDS-Page 變性膠電泳，條件為80 V，20 min 后，將電壓調至120 V，繼續電泳90 min；恒流290 mA 轉移至PVDF 膜，5%脫脂牛奶封閉1 h 后，孵育使用相關一抗，4℃振搖過夜；次日5% PBST 洗膜，10 min，4 次；孵育對應的二抗，振搖1 h，5% PBST 洗膜，10 min，3 次；暗房曝光顯影，并進行相應的定量分析。

1.2.6 免疫熒光檢測FAM134B 亞細胞分布 培養的N2a 細胞胰蛋白酶消化后接種至24 孔板爬片中，經不同處理后，使用4%多聚甲醛固定，0.1% Triton/PBS進行滲透打孔后；5% BSA/PBS 進行封閉；一抗室溫孵育1 h；PBS 洗5 次，5 min/次；孵育相對應二抗，室溫孵育1 h；PBS 洗5 次，5 min/次；Dapi 染細胞核3 min，轉移反扣至載玻片上，封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察及拍照。

1.3 統計學方法

采用SPSS 13.0 統計軟件進行分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組比較采用t檢驗，多組間比較用方差分析，進一步兩兩比較使用LSD-t檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 膿毒癥大鼠腦組織中內質網蛋白FAM134B的表達情況

采用CLP 方法成功復制膿毒癥大鼠模型，對照組FAM134B mRNA 表達水平為（1.000±0.223），CLP組為（0.430±0.251），兩組比較，差異有統計學意義（t=3.229，P=0.032），CLP組FAM134B mRNA表達水平低于對照組。對照組和CLP組FAM134B FAM134B 蛋白表達水平分別為（0.398±0.112）和（1.000±0.185），兩組比較，差異有統計學意義（t= 5.021，P=0.019），CLP組中FAM134B 蛋白表達水平低于對照組，見圖1。

圖1 膿毒癥大鼠腦組織中內質網蛋白FAM134B 的表達情況

2.2 LPS 誘導膿毒癥細胞模型中內質網自噬及細胞凋亡

免疫熒光結果顯示，對照組中，FAM134B 主要呈現內質網分布，同時，在20mg/L LPS 處理組中，可以看到在細胞質中FAM134B 呈現很多點狀分布，在LPS 處理后，細胞內質網合成及降解穩態被破壞，大量不能降解的內質網聚集在細胞中。Western blotting檢測結果顯示，各組FAM134B、LC3-Ⅱ、Beclin1、Activated Caspase-3 表達水平比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。LPS 處理組FAM134B蛋白總量下降，10mg/L LPS 處理組、20mg/L LPS 處理組FAM134B 蛋白總量與對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），LPS 處理組FAM134B 蛋白總量下降。同時，10mg/L LPS 處理組、20mg/L LPS 處理組中自噬相關蛋白LC3-Ⅱ及Beclin1 表達量與對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），LPS 處理組增加。10mg/L LPS 處理組、20mg/L LPS 處理組凋亡相關蛋白Activated Caspase-3 表達與對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），LPS 處理組高于對照組。利用Annexin V-FITC/PI 雙染流式細胞儀分析各組細胞凋亡率，對照組、10mg/L LPS 處理組、20mg/L LPS 處理組細胞凋亡率分別為（4.87±1.24）%、（11.12±1.33）%及（20.85±3.72）%，經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=61.400，P =0.000），10mg/L LPS 處理組、20mg/L LPS 處理組細胞凋亡率高于對照組（P＜0.05），見圖2和表1。

2.3 過表達FAM134B 對自噬及凋亡相關蛋白表達的影響

圖2 LPS 誘導膿毒癥細胞模型中內質網自噬及細胞凋亡

表1 不同濃度LPS 處理N2a 細胞后LC3-Ⅱ、Beclin1、Activated Caspase-3 蛋白表達水平比較（±s）

表1 不同濃度LPS 處理N2a 細胞后LC3-Ⅱ、Beclin1、Activated Caspase-3 蛋白表達水平比較（±s）

注：?與對照組比較，P ＜0.05。

組別 LC3-Ⅱ Beclin1 Activated Caspase-3對照組 1.00±0.134 1.00±0.183 1.00±0.153 10 mg/L LPS 處理組 1.88±0.244? 1.92±0.252? 2.21±0.312?20 mg/L LPS 處理組 3.95±0.449? 3.87±0.321? 4.56±0.572?F 值 69.220 95.422 88.635 P 值 0.000 0.000 0.000

過表達FAM134B 后LPS 處理，各組LC3-Ⅱ、Beclin1、Activated Caspase-3 相對表達水平比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。過表達FAM134B 后處理LPS，FAM134B OE+LPS（20mg/L）組自噬相關蛋白LC3-Ⅱ及Beclin1 及凋亡相關蛋白Activated Caspase-3 與20mg/L LPS 處理組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），FAM134B OE+LPS（20mg/L）組的表達量減少。利用Annexin V-FITC/PI 雙染流式細胞儀分析，對照組、20mg/L LPS 處理組、FAM134B OE+LPS（20 mg/L）組凋亡率分別為（4.87±1.24）%、（20.85±3.72）%及（9.65±2.67）%，經單因素方差析，差異有統計學意義（F=59.180，P =0.000）；FAM134B OE+LPS（20mg/L）組細胞凋亡與20 mg/L LPS 處理組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），FAM134B OE+LPS（20 mg/L）組較20 mg/L LPS 處理組細胞凋亡率減少，FAM134B 對LPS 對細胞損害具有一定保護作用，見圖3和表2。

圖3 過表達FAM134B 減少LPS 對細胞的損害

表2 過表達FAM134B 后各組LC3-Ⅱ、Beclin1、Activated Caspase-3 蛋白表達水平比較（±s）

表2 過表達FAM134B 后各組LC3-Ⅱ、Beclin1、Activated Caspase-3 蛋白表達水平比較（±s）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與20 mg/L LPS 處理組比較，P ＜0.05。

組別 LC3-Ⅱ Beclin1 Activated Caspase-3對照組 1.00±0.134 1.00±0.183 1.00±0.153 20 mg/L LPS 處理組 3.95±0.449① 3.87±0.321① 4.56±0.572①FAM134B OE+ LPS（20 mg/L）組 0.95±0.119② 0.87±0.154② 1.06±0.172②F 值 72.341 65.883 76.982 P 值 0.000 0.000 0.000

3 討論

炎癥反應和氧化應激在膿毒癥發病中起到重要作用[13]。膿毒癥發生時，中性粒細胞和單核細胞等炎癥細胞釋放IL-lα、IL-1β、IL-6 以及TNF-α 等促炎癥因子[14]。該炎癥因子可誘發過量的氧化應激反應，導致細胞代謝紊亂，促使細胞損傷。研究發現LPS 和促炎因子誘導細胞激活iNOS 活性，增加過氧化物水平，可直接或間接誘導細胞凋亡等病理生理損害[15-16]。

之前的膿毒癥發病機制研究較多的關注炎癥反應，氧化應激及線粒體損傷在膿毒癥發病中的作用，較少考慮到內質網自噬在膿毒癥發病中的功能[17-18]。內質網作為細胞生命中一個重要的細胞器，在蛋白質及脂質的合成和轉運中發揮至關重要的作用，且其參與細胞中膜結構的轉運等，參與線粒體功能的維持[19-20]。FAM134B 作為內質網上的一個重要蛋白，2015年研究發現，其可以通過與LC3B 相互作用，幫助將內質網碎裂，形成小片段從而被自噬體包裹，并與溶酶體融合降解，從而維持內質網穩態。本研究發現膿毒癥大鼠腦組織中內質網蛋白FAM134B 表達下降；LPS 誘導膿毒癥細胞模型中內質網自噬及細胞凋亡且過表達FAM134B減少LPS 對細胞的損害[10]。內質網應激在細胞凋亡及功能維持等生命過程中發揮重要作用，其與多種疾病相關，包括神經退行性疾病，缺血再灌注損傷，糖尿病等[9]。阿爾茲海默相關基因PS-1突變可以促進內質網應激從而導致神經元退行性死亡[21]。內質網應激也可以降低帕金森病相關基因Parkin 的表達，影響其對錯誤折疊蛋白如α-synuclein 等的清除，α-synuclein 蛋白的異常聚集是導致帕金森病發生的重要特征[22]。缺氧缺血可以導致異常折疊蛋白的聚集從而產生內質網應激，在灌注后使受損組織發生氧化應激，NO 和其他活性氧生成增加，鈣離子通道受損，從而導致細胞損傷[23]。胰島B 細胞具有成熟發達的內質網合成系統，其可分泌大量的胰島素及其他糖蛋白，嬰兒型糖尿病相關基因PERK 缺失，其可影響胰島B 細胞內質網結構，增加內質網應激，促使JNK 信號通路的異常活化，導致胰島素合成障礙[24]。

自噬是是細胞維持自身穩態的一個重要反應，過度自噬可誘導細胞凋亡，細胞死亡[25]。研究顯示LPS誘導的膿毒癥細胞模型自噬水平增加，細胞凋亡增多，其主要可以通過IL-lα、IL-1β、IL-6 以及TNF-α等促炎癥因子發揮功能，也可誘導線粒體自噬，細胞能量代謝異常導致[26-27]。本研究同時發現，LPS 處理中，FAM134B 在內質網中的分布發生異常，成聚集點狀分布，其可能誘導內質網自噬而聚集無法降解相關，進一步檢測發現自噬及凋亡相關蛋白表達發生改變，且在過表達FAM134B 后此現象得到改善，說明FAM134B能減少LPS 對細胞的損害，進一步證實FAM134B 介導的內質網自噬影響膿毒癥的發生，為深入了解膿毒癥的發病機制具有重要意義。