乙型肝炎病毒感染伴焦慮患者體內免疫應答研究*

尹家麗，楊海清

（云南省第三人民醫院 檢驗科，云南 昆明 650000）

慢性乙型肝炎是臨床常見的傳染性疾病，除對肝臟造成損傷外，還可引起其他系統的疾病[1-2]。研究發現，慢性乙型肝炎病毒感染的患者發生心理疾病的概率較高，其中最突出的為焦慮癥[3-4]。焦慮狀態不僅直接影響患者配合治療的態度，還可對機體免疫功能造成一定影響[5-6]。以往關于慢性乙型肝炎合并焦慮癥患者機體免疫應答的研究較少，本研究旨在分析該類患者在抗病毒治療過程中免疫功能的變化，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2015年1月—2017年1月云南省第三人民醫院收治的慢性乙型肝炎患者90例。其中，男性48例，女性42 例；年齡30～72 歲，平均（55.8±5.1）歲；病程7～40年，平均（22.3±5.4）年；有癥狀52 例，無癥狀38 例。根據焦慮自評量表（self-rating anxiety scale,SAS）評分將其分為焦慮組（SAS 評分≥50 分）和對照組（SAS 評分＜50 分），每組45 例。另取同期參加體檢的健康志愿者45 例作為空白組。納入標準：①符合2010年版《慢性乙型肝炎防治指南》中關于慢性乙型肝炎的診斷標準[7]；②乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）DNA 陽性（HBV DNA ≥1×103copy/ml），乙型肝炎表面抗原陽性≥6 個月或既往有乙型肝炎表面抗原陽性史，目前仍為陽性[8]；③本研究前3 個月內未使用抗病毒藥物、糖皮質激素等影響免疫功能的藥物。排除標準：①合并其他病毒性肝炎、酒精性肝炎和藥物性肝損傷患者；②合并肝細胞癌者；③合并自身免疫性疾病者；④合并嚴重高血壓、糖尿病或重要器官功能不全者。研究經本院醫學倫理委員會審批通過，所有研究患者知情并簽署知情同意書。3組一般資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。見表1。

表1 3組一般資料的比較（n =45）

1.2 儀器與試劑

TGL16MB 高速離心機（長沙湘智離心機有限公司），HWS-20 恒溫水浴箱（太倉市實驗設備廠），艾森D2060R 流式細胞儀、流式試管及配套設備（艾森生物杭州有限公司），帝肯F50 型酶聯免疫檢測儀及白細胞介素-2（IL-2）、白細胞介素-4（IL-4）、白細胞介素-10（IL-10）、干擾素（Interfern,IFN）和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor,TNF）檢測試劑（瑞士Tecan 公司），淋巴細胞亞群試劑（艾森生物杭州有限公司），冷凍保存S180 艾氏腹水癌細胞（上海長征醫院）。

1.3 方法

1.3.1 治療方法 在一般保肝抗炎的基礎上，給予阿德福韋酯片（福建廣生堂藥業股份有限公司，國藥準字H20070198）10 mg，口服，1 次/d，胸腺肽注射液（云南南詔藥業有限公司，國藥準字H53021765）40 mg，靜脈滴注，1 次/d，療程均為1年。

1.3.2 血清細胞因子檢測 治療前及治療12 周后取研究對象空腹靜脈血15 ml，經抗凝、離心等處理后獲得血清樣本，通過酶聯免疫吸附試驗檢測IL-2、IL-4、IL-10、IFN 及TNF 含量。

1.3.3 外周血淋巴細胞亞群檢測 治療前及治療12 周后分別取流式試管3 支，編號1～3。向試管1 加入20 μl CD4-PE，向試管2 加入20 μl CD3-PC，向試管3 加入20 μl CD3-PC5/CD4-PE 雙色試劑，后將抗凝全血加入上述試管，避光孵育25 min。取出試管，依次在其中加入400 μl 磷酸鹽緩沖液（PBS）和紅細胞裂解液OptiLyse C，震蕩搖勻，避光孵育20 min。2 000 r/min 離心10 min 后將液體倒出，加入400 μl PBS 液震蕩搖勻制備單細胞懸液。采用流式細胞儀檢測單細胞懸液，通過軟件分析并計算淋巴細胞中各標記細胞的比例[9]。

1.3.4 紅細胞免疫指標檢測 治療前及治療12 周后制備紅細胞懸液和自身血漿各50 μl，加入100 μl細胞懸液充分混勻，在37℃溫度下水浴20 min，加入0.25%戊二醛和生理鹽水各100 μl。反應液均衡涂片，甲醇固定，烘干后加20 μl 瑞吉氏染液染色，采用郭峰法計算協同腫瘤紅細胞花環率（associate tumor erythrocyte rosette rate,ATERR）、自然腫瘤紅細胞 花環率（natural tumor erythrocyte rosette rate,NTERR）、紅細胞C3b 受體花環率（red blood cell-C3b receptor rate 及紅細胞免疫復合物花環率（red blood cellimmune complex rosette,RBC-ICR）[10]。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS18.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，治療前后的比較采用配對t檢驗；計數資料采用例表示，比較用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組血清細胞因子的比較

治療前3組IL-2、IL-4、IL-10、IFN 及TNF 水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05），各指標水平由高到低均依次為空白組、對照組和焦慮組。與治療前比較，治療12 周后焦慮組和對照組IL-2、IL-4、IL-10、IFN和TNF 水平均有所增加（P＜0.05）。治療12 周后對照組各指標高于焦慮組（P＜0.05）。見表2。

2.2 3組外周血淋巴細胞亞群比例的比較

3組治療前CD3+CD4+、CD8+、CD4+、CD4+/CD8+水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05），CD3+CD4+、CD4+和CD4+/CD8+水平由高到低依次為空白組、對照組和焦慮組，CD8+由高到低依次為焦慮組、對照組和空白組（P＜0.05）。與治療前比較，治療12 周后焦慮組和對照組CD3+CD4+、CD4+和CD4+/CD8+有所升高，CD8+下降（P＜0.05）。治療12 周后對照組CD3+CD4+、CD4+和CD4+/CD8+高于焦慮組，CD8+低于焦慮組見表3。細胞因子流式細胞結果分析見圖1。

表2 3組血清細胞因子的比較（n =45，ng/L，±s）

表2 3組血清細胞因子的比較（n =45，ng/L，±s）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與治療前比較，P ＜0.05。

IL-2 IL-4 IL-10 IFN TNF治療前 治療12 周 治療前 治療12 周 治療前 治療12 周 治療前 治療12 周 治療前 治療12 周焦慮組 0.9±0.2 7.7±1.6①② 1.2±0.3 2.8±0.6①② 4.1±0.8 8.2±1.9①② 1.2±0.3 3.0±1.1①② 5.6±0.9 9.6±1.9①②對照組 2.4±0.5 9.2±1.8② 3.4±1.0 4.1±1.5② 6.6±1.3 11.5±2.0② 1.7±0.4 4.6±0.9② 8.2±1.7 13.2±2.5②空白組 13.0±2.4 - 5.8±1.1 - 15.9±2.7 - 5.8±1.0 - 18.3±2.7 -F/ t 值 33.704 12.326 27.064 16.061 28.109 15.645 29.556 7.552 29.934 17.677 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.002 0.000 0.000組別

表3 3組外周血淋巴細胞亞群比例的比較（n =45，±s）

表3 3組外周血淋巴細胞亞群比例的比較（n =45，±s）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與治療前比較，P ＜0.05。

CD3+CD4+/% CD8+/% CD4+/% CD4+/CD8+治療前 治療12 周 治療前 治療12 周 治療前 治療12 周 治療前 治療12 周焦慮組 23.1±2.2 26.0±2.1①② 34.6±3.5 31.3±2.4①② 28.6±2.9 32.8±2.5①② 1.0±0.2 1.2±0.1①②對照組 26.3±2.5 28.9±2.3② 30.8±2.9 27.2±1.9② 32.5±3.3 36.5±2.9② 1.2±0.1 1.4±0.1②空白組 32.2±3.4 - 24.3±2.8 - 40.3±3.7 - 1.6±0.2 -F/ t 值 15.074 10.407 15.415 12.733 16.695 11.267 14.230 12.002 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000組別

圖1 細胞因子流式細胞圖

2.3 3組紅細胞免疫指標比較

3組治療前ATERR、NTERR、RBC-C3bRR、RBC-ICR 水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05），ATERR、NTERR 和RBC-C3bRR 水平由高到低依次為空白組、對照組和焦慮組，RBC-ICR 由高到低依次為焦慮組、對照組和空白組。與治療前比較，治療12 周后焦慮組和對照組ATERR、NTERR 和RBCC3bRR 有所升高，RBC-ICR 下降（P＜0.05）。治療12周后對照組ATERR、NTERR 和RBC-C3bRR 高于焦慮組，RBC-ICR 低于焦慮組（P＜0.05）。見表4。

表4 3組紅細胞免疫指標的比較（n =45，%，±s）

表4 3組紅細胞免疫指標的比較（n =45，%，±s）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與治療前比較，P ＜0.05。

ATERR NTERR RBC-C3bRR RBC-ICR治療前 治療12 周 治療前 治療12 周 治療前 治療12 周 治療前 治療12 周焦慮組 42.3±3.5 47.3±3.0①② 1.0±0.2 1.2±0.2①② 11.2±1.8 13.8±0.9①② 20.3±2.6 16.2±1.8①②對照組 48.6±3.4 51.5±2.4② 1.2±0.2 1.5±0.2② 14.5±1.6 16.2±1.2② 17.6±1.9 14.0±1.5②空白組 56.3±5.6 - 1.8±0.2 - 18.6±1.7 - 11.3±1.2 -F / t 值 14.221 7.334 18.974 14.230 20.050 16.740 21.083 15.194 P 值 0.000 0.002 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000組別

3 討論

慢性乙型肝炎是我國常見的傳染性疾病，不僅對肝細胞造成直接損傷，還會對多系統造成影響，尤其是免疫功能的下降，目前最具有代表性的為細胞免疫和紅細胞免疫指標[11-12]。慢性乙型肝炎患者往往病程較長，在疾病狀態、家庭和社會壓力下容易出現焦慮的狀態，隨著社會的發展，慢性乙型肝炎合并焦慮癥患者的比例呈逐年遞增的趨勢，該類患者對治療的配合程度直接影響療效，但同時焦慮產生的應激對免疫功能產生負性作用，因此在治療過程中輔以心理疏導對提高療效、改善患者生活質量具有重要意義[13-14]。

本研究結果顯示，與治療前比較，治療12 周后焦慮組和對照組IL-2、IL-4、IL-10、IFN 和TNF 水平均有所增加，說明隨著治療時間的延長，細胞因子分泌水平逐漸增加，阿德福韋酯聯合胸腺肽可打破機體的免疫耐受，重建患者的免疫功能，效果肯定。治療前3組各指標水平由高到低均依次為空白組、對照組和焦慮組，與胥德廣等[15]的結果一致，驗證了焦慮狀態對患者的免疫功能產生的負性作用。與治療前比較，治療12 周后焦慮組和對照組CD3+CD4+、CD4+和CD4/CD8 有所升高，CD8+下降，佐證了上述細胞因子所得的結果。治療前3組CD3+CD4+、CD4+和CD4/CD8 水平由高到低依次為空白組、對照組和焦慮組，CD8+由高到低依次為焦慮組、對照組和空白組。ATERR、NTERR、RBC-C3bRR 和RBC-ICR 是 紅 細胞免疫的主要指標，對機體免疫過程中的促進與抑制作用敏感性較高，與治療前比較，治療12 周后焦慮組和對照組ATERR、NTERR 和RBC-C3bRR 有所升高，RBC-ICR 下降，說明治療一方面提高紅細胞運輸及清除免疫復合物的能力，另一方面降低RBC-ICR 的免疫抑制作用。治療前3組ATERR、NTERR 和RBCC3bRR 水平由高到低依次為空白組、對照組和焦慮組，RBC-ICR 由高到低依次為焦慮組、對照組和空白組，說明焦慮狀態同樣對紅細胞免疫功能產生負性影響。以上結果表明，在治療慢性乙型肝炎患者前應充分了解患者的心理狀態，對SAS 評分較高的患者開展針對性的心理護理，減輕焦慮狀態，提高患者對治療的信心及依從性。

綜上所述，阿德福韋酯聯合胸腺肽治療可對慢性乙肝患者的免疫功能進行重建，上調Th1 和Th2 細胞的表達水平，提高細胞免疫及紅細胞免疫功能，然而焦慮狀態對免疫功能的改善產生負性作用，在抗病毒治療的基礎上可結合心理疏導，從而提高療效。