銅綠假單胞菌臨床感染的耐藥性及毒力基因分析

林雅寧，劉惠娜，占景華，徐忠玉

(第九○九醫院/廈門大學附屬東南醫院檢驗科，福建漳州 363000)

銅綠假單胞菌(PA)是臨床上常見的條件致病菌，在自然界分布廣泛，對環境抵抗力較強[1]。隨著廣譜抗菌藥物的普遍使用，該菌耐藥性明顯上升。PA的致病機制與Ⅲ型分泌系統(T3SS)密切相關，毒力基因exoS和exoU在PA致病中起著重要作用。為了提高醫院抗菌治療效果和指導臨床合理使用抗菌藥物，現對2016-2017年本院臨床分離的1 000株PA和43株多藥耐藥PA菌株的毒力基因進行研究分析。

1 資料與方法

1.1一般資料 1 000株PA來自2016-2017年全院臨床各科室送檢的住院患者標本，包括痰液標本726株，分泌物144株，中段尿44株，血液28株，胸腹腔積液26株，其他32株。同一患者多次分類的菌株不重復計入。

1.2方法

1.2.1菌株鑒定及藥敏試驗 細菌培養鑒定按照《全國臨床檢驗操作規程》進行，運用WalkAway 96 Plus全自動微生物分析儀對菌株進行鑒定及藥敏試驗，以PA ATCC 27853作為質控菌株。

1.2.2毒力基因exoS和exoU的檢測 采用煮沸法提取DNA模板，委托上海生工合成兩對特異度引物對其進行PCR擴增，上下游引物參考文獻[2]。

1.2.3統計學處理 在Excel上進行數據分析及統計學處理，計數資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1耐藥率 1 000株PA對9種常用抗菌藥物均有不同程度的耐藥，其中對阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦、環丙沙星、美羅培南和亞胺培南有較好的藥物敏感活性，對頭孢他定和頭孢吡肟耐藥率較高。見表1。

表1 1 000株PA對9種抗菌藥物的耐藥率

2.2毒力基因exoS和exoU的檢測 以exoS和exoU特異度引物擴增相應片段，43株多藥耐藥PA中exoS(+)33株，exoU(+)6株。根據PCR結果統計這43株PA的毒素基因攜帶情況，其中exoS(+)/exoU(-)基因型共有33株，占78.6%；exoS(-)/exoU(+)基因型有6株，占14.3%；exoS(-)/exoU(-)基因型有4株，占7.1%。

2.3不同基因型的耐藥率比較 exoS(-)/exoU(+)基因型對抗菌藥物耐藥率基本高于exoS(+)/exoU(-)組，尤其對環丙沙星、頭孢他啶、美羅培南和頭孢吡肟的耐藥性exoS(-)/exoU(+)明顯高于exoS(+)/exoU(-)，耐藥率差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組含毒力基因的PA對9種抗菌藥物的耐藥情況

3 討 論

PA是一種重要的醫院感染條件致病菌，可以感染人體任何組織部位。醫院2016-2017年共檢出1 000株，標本類型構成比由高至低依次為痰液726株(72.6%)，分泌物144株(14.4%)，尿液44株(4.4%)，血液標本28株(2.8%)，胸腹腔積液26株(2.6%)，其他標本32株(3.2%)。其中分離到的痰液標本略低于同類報道的78.01%[3]，但遠比余昊等[4]報道的61.7%高。說明呼吸道為PA醫院感染的高發部位，應注意預防呼吸道發生醫院感染。

PA耐藥情況很嚴重，這與PA的內外因密切相關，外因就是抗菌藥物的廣泛使用，內因就是該菌具有特殊的細胞壁和細胞膜結構，對許多抗菌藥物存在固有耐藥，其耐用機制復雜。表1顯示PA對阿米卡星的藥物敏感度最好，可能是阿米卡星對該菌產生的鈍化酶比較穩定，與楊燕等[5]、孫敏等[6]報道一致。其次對哌拉西林/他唑巴坦、環丙沙星、美羅培南和亞胺培南也有較好的藥物敏感度，這與全國2012-2013年的“中國CHINET細菌耐藥性監測”資料吻合[7-8]。對三代頭孢他啶耐藥率為42.2%，略高于王靜等[9]報道的32.39%。這可能與近年來該抗菌藥物的廣泛使用有關。

PA致病是由多種致病因子實現的，其中T3SS是PA的一個重要毒力因子分泌系統，可以將編碼的毒力蛋白直接注入宿主細胞中，導致細胞死亡[10]。本研究對臨床分離的43株多藥耐藥PA進行毒力基因exoS和exoU檢測與分析。結果表明，exoS基因攜帶率78.6%遠高于exoU基因的14.3%，且只存在exoS(+)/exoU(-)、exoS(-)/exoU(+)或exoS(-)/exoU(-) 3種基因型。據報道，對于exoU和exoS基因，一般情況下，每株PA只攜帶其中的一種基因，exoS和exoU不同時存在同一菌株[11-12]。本研究沒有發現基因型為exoS(+)/exoU(+)的菌株。但是鞠曉紅等[13]分離的63株銅綠假單胞中34株菌(53.97%)同時攜帶兩種毒力基因。

通過對兩組含不同毒力基因的PA對9種抗菌藥物的耐藥率的分析，exoS(+)/exoU(-)和exoS(-)/exoU(+)基因型的PA對美羅培南、環丙沙星、左氧氟沙星和頭孢吡肟等的耐藥率差異具有統計學意義。國外研究，WONG等[14]研究者分離到的臨床PA攜帶exoS菌株高于exoU(62%vs.27%)，且對左氧氟沙星耐藥率exoS菌株高于exoU菌株(92.0%vs.61.0%)。可能的機制為exoS(-)/exoU(+)菌株多表現為主動外排泵相關基因的過度表達或者突變[15]。本研究也表明exoU菌株對于環丙沙星等喹諾酮類抗菌藥的耐藥率高于exoS，但未對其具體機制進行深入研究與探討。

綜上所述,PA在醫院表現出多藥耐藥，且以exoS為主，雖然攜帶exoU的菌株所占比例較低，但其耐藥率高，對其具體機制值得深入研究與探討。