血清HE4與miRNA-21在上皮性卵巢癌中的表達(dá)及相關(guān)性研究

吳 玉，劉慶峰，李雨婷

(1.廣州市紅十字會醫(yī)院檢驗科，廣東廣州 510220；2.廣州醫(yī)科大學(xué)金域檢驗學(xué)院，廣東廣州 510182)

卵巢癌是最致命的婦科惡性腫瘤，也是導(dǎo)致女性癌癥死亡的第五大原因，其中，上皮性卵巢癌(EOC)占所有卵巢癌的90%，因其早期癥狀不明顯，且進(jìn)展迅速、易于播散等特點，通常確診時大多數(shù)已進(jìn)入中晚期階段[1]。目前超聲和糖鏈抗原125(CA125)檢測是國內(nèi)EOC常見的篩查手段[2]，但超聲診斷靈敏度和特異度低，CA125在其他非卵巢惡性腫瘤及非腫瘤相關(guān)疾病中也有一定的陽性率，故在病理診斷前，尋找快速有效的EOC早期診斷實驗室指標(biāo)具有十分重要的意義。

已有大量研究表明人附睪蛋白4(HE4)在EOC患者血清中高度表達(dá)，可作為EOC早期診斷、病理分期及預(yù)測腫瘤轉(zhuǎn)移和預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)[3-4]。近年來，有少量研究表明，微小RNA-21(miRNA-21)水平的表達(dá)與EOC臨床分期、淋巴轉(zhuǎn)移存在明顯相關(guān)性[5]。但目前關(guān)于HE4和miRNA-21在EOC中相關(guān)性研究報道甚少，因此，本文旨在探討HE4和miRNA-21在EOC中的表達(dá)變化以及相關(guān)性研究，以期為EOC的早期診斷和臨床治療提供新的觀察指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年3月至2018年3月在廣州市紅十字會醫(yī)院(下稱本院)腫瘤科和婦科二區(qū)收治的80例臨床資料完整的初診EOC患者作為試驗組，年齡32～65歲，平均(52.6±7.31)歲;病理組織學(xué)分型，漿液性腺癌42例，黏液性腺癌38例；依照國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)臨床分期標(biāo)準(zhǔn)[6]，Ⅰ期17例，Ⅱ期28例，Ⅲ～Ⅳ期35例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者49例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者31例。隨機(jī)選取同時期本院收治的40例良性卵巢腫瘤患者作為良性組，30例體檢健康者作為對照組。良性組患者年齡36～62歲，平均(53.2±6.59)歲；對照組患者年齡(34～64)歲，平均(54.5±6.05)歲。3組患者在年齡等基線資料方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)試驗組和良性組均為初診卵巢腫瘤患者，均經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診；(2)所有患者或家屬均知情本次研究，并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并有其他感染性疾病、惡性腫瘤、自身免疫性疾病、嚴(yán)重貧血等血液系統(tǒng)疾病、血栓及出血性疾病者；(2)入院前使用抗菌藥物、抗凝藥物、激素、含氮藥物及大量失血等影響各指標(biāo)檢測結(jié)果者。

1.2儀器與試劑 羅氏cobas e601全自動化學(xué)發(fā)光儀及配套試劑購于德國羅氏診斷有限公司；Trizol試劑盒購于美國Invitrogen公司；DNA提取、逆轉(zhuǎn)錄、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(q-PCR)試劑盒和miRNA-21試劑盒均購于美國ABI公司；引物由上海生工公司合成。低溫高速離心機(jī)購于長沙湘儀儀器公司，小型超速離心機(jī)及移液器購于德國eppendorf公司，real-time PCR檢測儀ABI 7500購于美國ABI公司，minicycler PCR擴(kuò)增儀購自美國Perkin Elmer公司。

1.3血清HE4檢測 所有研究對象均于清晨空腹采集3 mL靜脈血置于促凝管中，4 000 r/min離心10 min，留取上清進(jìn)行HE4水平的檢測。檢測采用電化學(xué)發(fā)光法，儀器及試劑為羅氏cobas e601全自動化學(xué)發(fā)光儀及配套試劑。操作嚴(yán)格按照實驗室標(biāo)準(zhǔn)化文件進(jìn)行，并每日進(jìn)行質(zhì)量控制，所有結(jié)果均為當(dāng)日質(zhì)量控制在控結(jié)果。q-PCR檢測miRNA-21的方法描述要簡化，屬于試劑盒范疇的內(nèi)容可以簡略描述。

1.4q-PCR檢測miRNA-21 將500 μL血清樣本加入1 mL總RNA提取液中，根據(jù)Trizol試劑盒的說明書進(jìn)行總RNA的提取，紫外線分光光度計A260/A280比值下測量A值計算總RNA純度及濃度的檢測。(1)使用Poly(A)Tailing Kit試劑盒按說明書進(jìn)行5′末端加尾。(2)cDNA合成：使用TaqMan miRNA Reverse Transcription Kit試劑盒按照說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，整個過程于冰上完成，逆轉(zhuǎn)錄的條件為:16 ℃ 30 min;42 ℃ 30 min;85 ℃ 5 min。(3)q-PCR反應(yīng)：使用20 μL反應(yīng)體系，循環(huán)條件為:95 ℃變性15 s，60 ℃條件下退火或延伸1 min，進(jìn)行40個循環(huán)。試驗在不同時間點進(jìn)行至少3次重復(fù)，計算各組2-△△Ct值。miRNA-21檢測引物按相關(guān)參考文獻(xiàn)[7]合成，見表1，miRNA-21內(nèi)參基因為U6。

表1 HE和miRNA-21引物序列

2 結(jié) 果

2.1各組患者血清HE4和miRNA-21表達(dá)的比較 試驗組血清HE4水平和miRNA-21相對表達(dá)量明顯高于良性組和對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；良性組和對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.2試驗組患者血清HE4和miRNA-21表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 試驗組患者臨床Ⅲ～Ⅳ期、漿液型和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者血清HE4和miRNA-21表達(dá)水平明顯高于臨床0～Ⅱ期、黏液型和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表2 各組患者血清HE4和miRNA-21表達(dá)的比較

注：*與良性組和對照組相比較,P<0.05

表3 試驗組患者血清HE4和miRNA-21表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.3EOC患者血清HE4和miRNA-21的相關(guān)性分析 Pearson分析發(fā)現(xiàn)血清HE4和miRNA-21間呈正相關(guān)性(r=0.264，P=0.018)。見圖1。

圖1 EOC患者血清HE4和miRNA-21的相關(guān)性分析

3 討 論

卵巢癌是婦科腫瘤所致死亡的主要原因，而與其惡性生物學(xué)行為相關(guān)的機(jī)制尚不清楚。EOC是卵巢癌的主要病理類型，其早期診斷有助于疾病的早期治療、改善預(yù)后以及挽救患者生命。目前，血清腫瘤標(biāo)志物篩查是EOC的主要篩查指標(biāo)，但其靈敏度和特異度等原因，腫瘤標(biāo)志物CA125用于EOC的診斷時仍具有局限性，故尋找新的生物學(xué)指標(biāo)對EOC的輔助診斷具有重要意義。

HE4是一種新興臨床腫瘤標(biāo)記物，其在健康人體中的表達(dá)呈限制性，而在卵巢癌患者，尤其是漿液性卵巢癌患者的血清中的表達(dá)可達(dá)90%以上，因此被認(rèn)為是EOC早期診斷、鑒別、治療監(jiān)測和預(yù)后評估標(biāo)志物[8]。有研究通過繪制ROC曲線分析得出HE4對EOC具有較高的診斷價值，其靈敏度和特異度均超過80%，診斷結(jié)果優(yōu)于CA125[9]。本研究中發(fā)現(xiàn)EOC患者血清HE4水平較卵巢良性腫瘤患者和健康體檢者明顯升高，且臨床分期Ⅲ～Ⅳ期患者、漿液性卵巢癌患者和有淋巴轉(zhuǎn)移患者的血清HE4水平顯著高于臨床分期0～Ⅱ期患者、黏液性卵巢癌患者和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者。這與陳靜[3]的研究結(jié)果一致，表明血清HE4水平可用于EOC患者臨床分期、病理分型和腫瘤轉(zhuǎn)移監(jiān)測。

miRNAs為非編碼短序列RNAs，其生物學(xué)功能差異表達(dá)在各種疾病的發(fā)生中均發(fā)揮著作用，通過與靶基因的mRNA作用，使得靶基因的mRNA發(fā)生降解，從而影響基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控，涉及的調(diào)控機(jī)制復(fù)雜多樣[10]。目前，miRNA在EOC中的研究逐漸受到人們的關(guān)注，包括miRNA-200、miRNA-30等[11]，miRNA-21在ECO中的作用逐漸受到人們的重視。萬冬等[12]采用q-PCR和Western blot方法檢測了miRNA-21在卵巢癌中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)卵巢癌患者可通過miRNA-21的上調(diào)，從而抑制程序性細(xì)胞死亡因子4(PDCD4)基因的表達(dá)，從而促進(jìn)卵巢腫瘤細(xì)胞增殖。于曉敏等[13]研究了血清miRNA-21的表達(dá)與EOC患者化療耐藥性及臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果表明miRNA-21水平在EOC患者中明顯升高，其可作為化療耐藥的的預(yù)測參考指標(biāo)。本研究中發(fā)現(xiàn)EOC患者血清miRNA-21水平較卵巢良性腫瘤患者和體檢健康者明顯升高，且臨床分期Ⅲ～Ⅳ期患者、漿液性卵巢癌患者和有淋巴轉(zhuǎn)移患者的血清miRNA-21水平顯著高于臨床分期0～Ⅱ期患者、黏液性卵巢癌患者和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者。這與曾玉等[5]、林麗慧等[14]的研究結(jié)果一致，表明血清miRNA-21可用于EOC的早期診斷和病情監(jiān)測。

目前關(guān)于血清HE4和miRNA-21聯(lián)合檢測對EOC診斷價值的相關(guān)報道甚少。本研究中，研究者通過Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)血清HE4和miRNA-21水平間呈正相關(guān)性(r=0.264，P<0.05)，與CHEN等[15]的報道結(jié)果相一致。這表明HE4和miRNA-21在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要重要，且二者間存在密切聯(lián)系，具體機(jī)制有待研究人員的進(jìn)一步研究。本研究尚未分析血清HE4和miRNA-21以及二者聯(lián)合對EOC的診斷價值，此為本次研究的不足之處，筆者將在后續(xù)的研究中進(jìn)行進(jìn)一步的數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，以期為提高EOC的臨床診斷價值提供理論依據(jù)。

綜上所述，血清HE4和miRNA-21的高表達(dá)與EOC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，且二者間存在明顯正相關(guān)性，可作為EOC診斷、轉(zhuǎn)移和預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)。