養殖密度對吉富羅非魚幼魚生長、免疫功能的影響

左 騰，黃 凱，汪 婷，劉 婷，宿志健，孫琳琳，莫飛杰，陳顯友

( 廣西大學 動物科學技術學院，廣西 南寧 530004 )

高密度養殖已成為一種提高生產力和經濟效益的有效方式[1]，同時會增大養殖魚類對空間和餌料的競爭，也伴隨著大量排泄物的產生，從而對水產養殖魚體生長和養殖水體環境產生影響。一方面，高密度養殖作為一種慢性應激，會對養殖魚體的生長、肌肉營養組成、免疫能力、血液學指標以及基因表達產生影響[2-4]；另一方面，養殖密度與水環境因子之間是相互聯系和制約的關系[5]，高密度養殖會產生較多的糞便，使養殖水體中的氨氮、亞硝酸鹽氮、硝態氮、磷酸鹽含量增高，增大細菌種群數及其生產力，從而產生大量營養負荷的養殖環境，最終抑制魚類生長[6-8]。因此，探索合理的養殖密度，在保障最大的生態效益的同時，獲得最高的經濟效益，是目前整個水產養殖行業所關注的焦點。

吉富羅非魚(OreochromisniloticusGIFT)為遺傳性狀改良后的尼羅羅非魚[9]。目前，國內外關于養殖密度對吉富羅非魚肌肉脂肪酸含量、抗氧化能力、脂類代謝相關酶mRNA水平等指標的影響已有研究[5,10]。為此，筆者開展了養殖密度對吉富羅非魚幼魚生長、免疫功能、肌肉營養成分和生理生化指標影響的研究，旨在為吉富羅非魚高產、安全、健康的集約化養殖提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗魚于2015年6月購自廣西水產研究院當年春季同一批次孵化的吉富羅非魚魚苗，養殖試驗在廣西大學水產養殖試驗教學基地的水泥池中進行。試驗前挑選健康無病、規格一致的羅非魚，暫養于5.0 m×1.0 m×1.0 m的水泥池中，投喂試驗飼料馴養。試驗飼料采購于南寧市海寶路水產飼料有限公司，粗蛋白為33.4%、粗脂肪為6.3%、粗纖維為6.9%、粗灰分為11.2%。暫養2周后挑選規格一致的羅非魚[初始體質量(1.05±0.12) g、初始體長(3.97±0.05) cm]隨機分配至1.7 m×1.0 m×0.6 m的水泥池中。根據文獻[11]以及基地試驗基本條件，試驗共設置6個養殖密度梯度(45、54、63、72、81尾/m3和90尾/m3)，每組設3個平行組。在90 d養殖過程中，日投喂2次(8:00，16:00)，前45 d每次投喂量為魚體質量的4%，隨殘餌量逐漸增大，后45 d每次投喂量改為魚體質量的3%，每次投喂20 min后打撈殘餌，并記錄殘餌量。每日8:00吸污并換水1/3。飼養期間水溫27～29 ℃，pH 8.0～8.2, 持續無間斷增氧,溶解氧3.0～5.0 mg/L。

1.2 樣品采集、測定

試驗開始前和結束后分別稱量并記錄初始體質量、終末體質量、初始體長和終末體長，計算體長增長率、體質量增加率、特定生長率和肥滿度。試驗結束后統計每組試驗魚死亡數以及投喂的飼料量，計算存活率和飼料系數。養殖試驗結束24 h后，各組隨機捕撈15尾試驗魚，尾部靜脈采集血液于醫用真空采血管保存，部分用于血液學分析，其余血液4 ℃、3000 r/min離心10 min，取上清液于-80 ℃保存，用7600-120型全自動生化分析儀測定血液指標；將采血后的魚體解剖并分離肝臟、脾臟和肌肉，計算肝臟系數和脾臟系數，并用105 ℃恒溫烘干濕質量法測定肌肉水分(GB/T 9695.15—2008)，用凱氏定氮法測定肌肉粗蛋白(GB/T 5511—2008)，用索氏抽提法測定肌肉粗脂肪(GB/T 14772—2008)，用馬福爐550 ℃灼燒恒定質量法測定肌肉粗灰分(GB/T 6438—2007)。

1.3 分析統計

試驗數據采用平均值±標準差表示，用SPSS 20.0統計軟件中單因子方差分析和Duncan多重比較對試驗結果差異顯著性進行分析，并用Origin 9.0軟件作圖，P<0.05表示差異顯著。

特定生長率/%·d=(lnmt-lnm0)/t×100%

肥滿度=mt/Lt3×100

存活率/%=(n0-n1)/n0×100%

飼料系數=m/(mt-m0)

體長增長率/%=(Lt-L0)/L0×100%

體質量增加率/%=(mt-m0)/m0×100%

肝臟系數/%=ml/mt×100%

脾臟系數/%=ms/mt×100%

白球比=Ca/Cg

式中，m0為試驗魚初始體質量(g)，mt為試驗魚終末體質量(g)，ml為試驗魚終末肝臟質量(g)，ms為試驗魚終末脾臟質量(g)，t為試驗時間(d)，Lt為試驗魚終末體長，L0為試驗魚初始體長，n0為試驗開始時試驗魚總數，n1為試驗魚死亡數，m為試驗飼料攝入量(g),Ca為血液中白蛋白質量濃度(g/L)；Cg為血液中球蛋白質量濃度(g/L)。

2 結果與分析

2.1 養殖密度對吉富羅非魚幼魚生長性能的影響

在90 d的養殖試驗后，各組間飼料系數和肥滿度無顯著差異(P>0.05)，吉富羅非魚終末體質量和終末體長隨養殖密度增大而顯著降低(P<0.05)(表1)。隨著養殖密度的增加，吉富羅非魚幼魚體質量增加率、體長增長率、特定生長率以及存活率呈降低趨勢，各組差異顯著(P<0.05)(圖1)。其中45尾/m3和54尾/m3試驗組，體質量增加率和特定生長率差異不顯著(P>0.05)，但顯著高于90尾/m3試驗組(P<0.05)；體質量增加率，45尾/m3試驗組顯著高于其他各組(P<0.05)，90尾/m3試驗組最低(P<0.05)，但54尾/m3和63尾/m3試驗組差異不顯著(P>0.05)； 45尾/m3、54尾/m3和63尾/m3試驗組體長增長率無顯著差異(P>0.05)，但顯著高于90 尾/m3試驗組(P<0.05)；存活率隨養殖密度增加顯著降低(P<0.05)，其中45尾/m3、54尾/m3和63尾/m3試驗組間無顯著差異(P>0.05)，但最低組(90尾/m3)與81尾/m3試驗組差異不顯著(P>0.05)。

表1 養殖密度對羅非魚生長指標的影響

注:表格中同行相同小寫字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同.

2.2 養殖密度對吉富羅非魚幼魚體成分的影響

各密度組吉富羅非魚幼魚肌肉水分含量存在差異，隨著養殖密度的增大呈上升趨勢(P<0.05)，其中90尾/m3試驗組最高，但63尾/m3、72尾/m3、81尾/m3試驗組和90尾/m3試驗間無顯著差異(P>0.05)；隨著養殖密度增大,肌肉粗蛋白、粗脂肪和粗灰分無顯著差異(P>0.05)，但90尾/m3試驗組蛋白和脂肪含量最低以及灰分含量最高(表2)。

圖1 不同養殖密度對羅非魚幼魚生長指標的影響相同小寫字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05).下同.

%

2.3 養殖密度對吉富羅非魚幼魚免疫指標的影響

吉富羅非魚幼魚肝臟系數和脾臟系數隨著養殖密度的增大呈下降趨勢，但差異不顯著(P>0.05)；90尾/m3試驗組白球比最低(P<0.05)，其中45尾/m3、54尾/m3和63尾/m3試驗組間差異不顯著(P>0.05)(表3)。血液中紅細胞數、白細胞數以及淋巴細胞數隨養殖密度增大而增多(P<0.05)(圖2)。其中45尾/m3、54尾/m3和63尾/m3試驗組紅細胞數無顯著差異(P>0.05)，90尾/m3試驗組紅細胞數和白細胞數顯著高于其他各組(P<0.05)；養殖密度大于54尾/m3時，淋巴細胞數顯著增多(P<0.05)，但72尾/m3、81尾/m3試驗組和90尾/m3試驗組差異不顯著(P>0.05)。白蛋白和球蛋白隨養殖密度增大呈下降趨勢(P<0.05)，其中45尾/m3試驗組含量最高，45尾/m3和54尾/m3試驗組吉富羅非魚白蛋白含量差異不顯著(P>0.05)(圖3)。

表3 養殖密度對羅非魚幼魚肝臟系數、脾臟系數以及白球比的影響

圖2 養殖密度對羅非魚幼魚血液免疫細胞數的影響

圖3 養殖密度對血液白蛋白和球蛋白質量濃度的影響

2.4 養殖密度對吉富羅非魚幼魚血液生理生化指標的影響

吉富羅非魚幼魚總蛋白質量濃度隨著養殖密度增大而降低，45尾/m3、54尾/m3試驗組無顯著差異(P>0.05)，但顯著高于其他各組(P<0.05)。隨養殖密度的增大，吉富羅非魚幼魚血紅蛋白質量濃度呈上升趨勢，90尾/m3試驗組顯著高于各試驗組(P<0.05)(表4)。谷丙轉氨酶含量隨羅非魚養殖密度變化顯著(P<0.05)，90尾/m3試驗組顯著高于其他各組(P<0.05)。45尾/m3、54尾/m3和63尾/m3試驗組堿性磷酸酶活性差異不顯著(P>0.05)，均顯著高于其他試驗組(P<0.05)，整體呈降低趨勢。本試驗中，血液谷草轉氨酶、尿素氮、血糖和游離三碘甲狀腺原氨酸變化不顯著(P>0.05)。90尾/m3試驗組血液游離甲狀腺素濃度最低(P<0.05)，其他各試驗組無顯著差異(P>0.05)。

3 討 論

3.1 養殖密度對吉富羅非魚幼魚生長性能的影響

有研究表明，高密度養殖會提高總產量，但是會限制養殖魚類生長，降低個體的平均質量[12]，在高密度條件下，養殖魚類的生長速率較低密度呈負增長[6]。對施氏鱘(Acipenserschrenckii)[3]、黑邊雙鋸魚(Amphiprionpercula)[13]和舌齒鱸(Dicentrarchuslabrax)[6]的研究結果也證明高養殖密度不利于魚類生長。也有學者研究發現，大西洋鱘(A.oxyrinchus)[14]和革胡子鲇(Clariasgariepinus)[15]終末體質量和特定生長率隨養殖密度的增加而顯著上升(P<0.05)。但Celikkale等[16]對俄羅斯鱘(A.gueldenstaedtii)的研究結果表明，其生長幾乎不受養殖密度的影響。筆者認為，當養殖密度較低時，適當提高密度對魚類生長有一定的促進作用, 但超過臨界養殖密度則不利于養殖魚類的生長[17]。在本研究中，吉富羅非魚幼魚終末體長和終末體質量與養殖密度呈負相關，體長增長率、體質量增加率、存活率以及特定生長率均隨養殖密度的增大而顯著降低(P<0.05)，其原因可能是在較低密度下“集群互利性”促進其生長[18]，高密度下魚類對養殖空間以及營養產生的競爭加劇，使“生理、環境和行為福利”降低而導致魚類生長受到抑制。

表4 養殖密度對羅非魚血液生化指標的影響

3.2 養殖密度對吉富羅非魚幼魚體成分的影響

3.3 養殖密度對吉富羅非魚幼魚免疫功能的影響

肝臟和脾臟分別是白蛋白和免疫球蛋白主要產生器官，是魚類重要免疫器官。免疫器官指數反映了免疫器官發育程度，一般來說免疫器官發育越完善，指數越大，機體免疫能力越強[25]。曹陽等[26]對俄羅斯鱘的研究發現，肝臟系數隨養殖密度呈負相關，低密度組(0.8 kg/m3)和中密度組(1.6 kg/m3)免疫性能較高密度組(3.2 kg/m3)更優。對施氏鱘[19]和虹鱒[27]的研究也發現，肝臟系數和脾臟系數與養殖密度呈反比。本試驗中，肝臟系數和脾臟系數隨養殖密度的增大而降低(P>0.05)；血液中白蛋白和球蛋白含量較低密度組(45尾/m3)顯著降低(P<0.05)。所以，高密度養殖可能會對羅非魚肝臟、脾臟的發育以及免疫能力有一定的影響。

血液中包含許多免疫因子，其中紅細胞、白細胞、淋巴細胞、白蛋白以及球蛋白是魚類細胞免疫和體液免疫的重要組成部分。Aketch等[1]研究發現，高密度養殖可使尼羅羅非魚紅細胞數升高。舌齒鱸[28-29]和雜交鱧(Channamaculata×C.argus)[30]的研究結果表明，紅細胞數隨養殖密度增大而顯著增多(P<0.05)。本試驗中，90尾/m3試驗組紅細胞數顯著高于其他各組(P<0.05)；白細胞數隨養殖密度增大而增多，90尾/m3試驗組最高(P<0.05)；養殖密度大于54尾/m3時淋巴細胞數顯著上升(P<0.05)。這可能是魚體在受到外界脅迫后，激活機體免疫防御體系，通過維持機體平衡來克服脅迫的保護效應。結合肝臟系數、脾臟系數、白蛋白和球蛋白隨養殖密度的變化情況可知，在持續的高密度脅迫下，魚體免疫機能可能受到抑制，從而使免疫能力降低[31]。

3.4 養殖密度對吉富羅非魚幼魚血液生理生化指標的影響

血液指標是評價動物健康狀態的重要指標，會因養殖魚種類、飼料原料以及養殖環境的不同而異。本試驗表明，隨養殖密度增大，吉富羅非魚幼魚血紅細胞數和血紅蛋白呈上升趨勢，這與舌齒鱸[29]、雜交鱧[30]和尼羅羅非魚[1]的研究結果相似。試驗采用連續增氧、定期換水的養殖模式，排除了養殖水環境對魚體的影響，在養殖過程中發現高密度組(81尾/m3和90尾/m3)溶解氧含量較低，這可能是高密度脅迫下魚體耗氧率增大[17]，從而增加了紅細胞分化和血紅蛋白表達，增強血液總攜氧能力。但也有學者認為，低密度養殖會引起魚類葡萄糖轉運蛋白基因上調，增強血紅蛋白在細胞間的運動，但高養殖密度下魚類需要更多的能量來應對脅迫，從而導致血紅蛋白減少[10]。

血清總蛋白是臨床上分析肝臟、腎臟疾病以及營養狀況的重要指標，尿素氮是蛋白質代謝的終末產物，血液中尿素氮含量在一定程度上反映了動物蛋白質代謝狀況，也是蛋白質沉積的重要指標。本研究發現，血清總蛋白隨養殖密度增大而顯著下降，尿素氮含量隨養殖密度增大而上升。這可能是魚體在高密度養殖下會產生較高能耗，使血清蛋白分解代謝增強[19,23]。本試驗中90尾/m3試驗組肌肉蛋白含量最低，這與血清總蛋白和尿素氮指標吻合，進一步說明了高密度養殖不利于吉富羅非魚蛋白質的沉積。Aketch等[1]對尼羅羅非魚的研究發現，血糖隨養殖密度增大呈上升趨勢，在虹鱒[27]和金頭鯛(Sparusauratus)[32]的研究中也得到證明。但Qiang等[10]發現，羅非魚在高密度組得到最低的血糖水平。也有研究表明，高密度對某些魚類的血糖幾乎沒有影響[33]。本研究結果表明，養殖密度對血糖無顯著影響，結合血液總蛋白和尿素氮的變化規律，分析原因可能為，高密度脅迫會促進血清總蛋白分解和脂肪代謝，加強糖異生作用，以維持高密度下機體的能耗[2,19,21,23-24]。

血液轉氨酶是臨床上診斷肝臟功能的重要指標，谷丙轉氨酶主要存在于肝細胞漿中，谷草轉氨酶主要存在于線粒體中，前者在肝細胞損傷時會首先進入血液，當肝細胞嚴重損傷、危及線粒體時，后者也會進入血液。對黃姑魚(Nibeaalbiflora)的研究發現[2]，4.84 kg/m3和5.81 kg/m3兩組試驗魚谷丙轉氨酶顯著高于其他組(P<0.05)，5.81 kg/m3組谷草轉氨酶活性最高(P<0.05)。本試驗中，吉富羅非魚幼魚血液中谷丙轉氨酶活性隨養殖密度增大而顯著上升(P<0.05)，谷草轉氨酶呈上升趨勢，但各組間差異不顯著，90尾/m3試驗組酶活性最高。堿性磷酸酶參與水生動物鈣化和膜轉運。研究發現，成骨細胞活性增加、膽汁淤積或慢性病都會引起血液中堿性磷酸酶的降低[10]。Rebl等[34]認為，在高密度養殖下虹鱒肝臟細胞受到脅迫，會導致mTOR和PI3K/AKT信號通路受損。本試驗中，吉富羅非魚幼魚白球比和堿性磷酸酶活力隨著養殖密度增大呈下降趨勢，45～81尾/m3組差異不顯著，90尾/m3試驗組顯著低于其他各組，這說明90尾/m3組試驗魚在高密度脅迫下肝臟細胞可能受到損傷。

4 結 論

綜上所述，吉富羅非魚體質量在1～60 g階段時，養殖密度為45尾/m3，對魚體生長和免疫功能不會造成損害。養殖密度達到或高于54尾/m3時，魚體生長發育和免疫功能會受到抑制。