共生菌對荷瘤小鼠肺泡巨噬細胞基因表達的調控作用

程民，毛菊，楊雯雯，吳新春，陳穩，徐婷娟，沈國棟，胡世蓮

[中國科學技術大學附屬第一醫院(安徽省立醫院)，安徽省老年醫學研究所，腫瘤免疫與營養治療安徽省重點實驗室,合肥 230001]

共生菌群被喻為呼吸道健康的“看門人(gatekeeper)”，在器官發育和免疫穩態維持中發揮重要作用，腸道共生菌與肺臟關系密切，在機體內形成“腸-肺”軸，遠端調控肺臟免疫穩態[1]。肺泡巨噬細胞是肺臟內最為豐富的固有免疫細胞，在啟動及調控肺臟免疫應答中發揮重要作用[2]。共生菌在肺泡巨噬細胞免疫穩態維持及抗腫瘤免疫應答中發揮著非常重要的調控作用[3-4]，共生菌對肺泡巨噬細胞免疫應答能力調控的分子機制是值得深入研究的科學問題。本研究通過篩選共生菌缺失荷瘤小鼠與正常荷瘤小鼠肺泡巨噬細胞中差異表達的基因并進行生物信息學分析，進而探討共生菌群對荷瘤小鼠肺泡巨噬細胞基因表達的調控作用。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物： C57BL/6小鼠(5～6周齡，雌性，SPF級)購自上海斯萊克實驗動物責任有限公司，22 ℃，55%濕度，12小時晝/夜節奏，所有實驗操作過程均遵循實驗動物管理規范條例執行。

抗菌藥物： 氨芐青霉素、新霉素、萬古霉素和甲硝唑等購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

細胞株及培養試劑： LLC細胞購自美國典型培養物保藏中心，DMEM液體培養基、胎牛血清、胰蛋白酶溶液及青霉素-鏈霉素溶液(100×)等購自HyClone公司。

流式抗體及細胞分離試劑等：anti-mouse F4/80(FITC)、anti-mouse CD11c(PE)、anti-mouse CD11b (PerCP-Cy5.5)抗體及同種型抗體購自BD公司，大鼠血清購自Reanta公司，PBS磷酸鹽緩沖液(干粉)購自北京索萊寶科技有限公司，Percoll溶液購自GE Healthcare公司，膠原酶I購自Sigma公司，Trizol試劑購自Invitrogene公司。

1.2 方法 構建共生菌缺失小鼠： 使用含有組合抗菌藥物的飲用水連續飼喂C57BL/6小鼠(5～6周齡，雌性，SPF級)4～6周，建立共生菌缺失小鼠模型。組合抗菌藥物水的配方為含1 g/L氨芐青霉素、1 g/L甲硝唑、1 g/L硫酸新霉素和0.5 g/L萬古霉素4種抗菌藥物的飲用水。飼喂期間觀測小鼠體質量變化、活動狀態等，對體質量降低嚴重(下降30%以上)的小鼠進行安樂死，健康對照組小鼠使用不含抗菌藥物的飲用水進行飼喂。

荷Lewis肺癌小鼠模型的構建： 利用共生菌缺失小鼠(抗菌藥物水飼喂5周)及正常對照小鼠(C57BL/6鼠，雌性，10 周齡，SPF級)，尾靜脈注射LLC細胞(2×106個/鼠，250 μL PBS)，建立荷Lewis肺癌小鼠模型[3]。

肺泡巨噬細胞的分離純化： 荷瘤21 d后，取共生菌缺失荷瘤小鼠及正常荷瘤小鼠各30只，每組分為2個樣品，15只小鼠/樣品，摘眼球放血后，脫臼處死，摘取肺臟，去除殘余血管后，將肺臟組織剪碎至直徑小于1 mm，使用DMEM 培養基(含0.1%膠原酶I，5%新生牛血清，100 u/mL青霉素，100 μg/mL 鏈霉素)重懸，之后37 ℃，200 r/min，消化1 h，將消化液通過200目的不銹鋼篩網，4 ℃，1 260 g，離心20 min，棄上清。將沉淀用40%的Percoll溶液重懸，輕加于70%的Percoll溶液上，25 ℃，1 260 g(升速1，降速0)，離心30 min，收集40%和70% Percoll溶液界面處的細胞，1×PBS溶液洗2遍(25 ℃，2 400 r/min，10 min)，大鼠血清封閉后，標記熒光抗體，使用流式細胞術分選，得到表型為F4/80+CD11c+的肺泡巨噬細胞。

基因芯片檢測： 將1.2.3中得到的肺泡巨噬細胞轉移至1.5 mL 無菌Ep管中，1×106個/管，1 260 g，4 ℃，離心10 min，棄上清，每管加入0.5 mL Trizol試劑溶解細胞，使用miRNeasy Mini Kit(貨號217004，Qiagene公司)進行RNA抽提，抽提所得總RNA經Agilent Bioanalyzer 2100電泳質檢合格后，交由上海伯豪生物技術有限公司完成表達譜基因芯片檢測，所用芯片為SBC-lncRNA(小鼠4×180k)芯片，具體操作按試劑盒說明書進行。

基因芯片結果分析： 完成雜交的芯片使用Agilent Microarray Scanner進行掃描，軟件設置為Dye channel:Green,Scan resolution=3 μm,PMT 100%,20 bit。用Feature Extraction software 10.7讀取數據，GeneSpring Software 11.0進行歸一化處理，利用變化倍數及t檢驗方法篩選差異基因，篩選條件為變化倍數≥2，P<0.05?；蚍诸?GO)、KEGG通路分析按照文獻[5-6]方法進行。

1.3 統計學處理 采用SPSS 17.0軟件進行數據分析，使用Origin 7.5軟件繪圖并解析。觀測數據均為計量資料，以mean±SEM表示，使用兩獨立樣本t檢驗比較各組樣本間的差異。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 共生菌缺失荷瘤小鼠與正常荷瘤小鼠肺泡巨噬細胞之間存在差異性表達的基因 利用流式細胞術對共生菌缺失荷瘤小鼠及正常荷瘤小鼠肺泡巨噬細胞進行分選，分選后的肺泡巨噬細胞(F4/80+CD11c+)純度在98%以上(圖1A)，利用基因芯片技術檢測上述純化后肺泡巨噬細胞的基因mRNA表達情況并篩選差異表達基因，結果表明，共生菌缺失荷瘤小鼠與正常荷瘤小鼠肺泡巨噬細胞之間差異倍數≥2的基因共有353個，其中上調基因171個(占48.4%)，下調基因182個(占51.6%)，如圖1B和圖1C所示。

2.2 共生菌缺失荷瘤小鼠肺泡巨噬細胞差異性表達基因的功能分析 對共生菌缺失荷瘤小鼠肺泡巨噬細胞差異性表達基因(變化倍數≥2)進行了GO及KEGG通路等分析。GO分析的結果表明，共生菌缺失后荷瘤小鼠肺泡巨噬細胞差異表達的基因GO分類主要為細胞凋亡、趨化作用、血管生成、分泌、細胞分化、細胞增殖、對刺激的反應性、運動、信號、多器官過程及免疫系統過程等(圖2A、圖2B)。KEGG通路分析結果表明，共生菌缺失后荷瘤小鼠肺泡巨噬細胞差異性表達基因主要與氮素代謝、趨化因子信號通路、TGF-β信號通路、腫瘤通路、細胞因子-細胞因子受體相互作用等信號通路密切相關(圖2C)。

注：WT+LLC為共生菌正常的荷瘤小鼠；Abx+LLC為共生菌缺失的荷瘤小鼠

圖1共生菌缺失對荷瘤小鼠肺泡巨噬細胞基因表達的影響

圖2 共生菌缺失荷瘤小鼠肺泡巨噬細胞差異表達基因的功能分析

2.3 共生菌缺失荷瘤小鼠肺泡巨噬細胞中M1/M2型巨噬細胞特異性基因的表達情況 對共生菌缺失荷瘤小鼠及正常荷瘤小鼠肺泡巨噬細胞中M1和M2型巨噬細胞特異性基因表達情況進行了分析，結果顯示，共生菌缺失荷瘤小鼠肺泡巨噬細胞中M2型巨噬細胞特異性基因CCL24、Arg1、Retnla及IL-13等表達上調(變化倍數≥2)，M1型巨噬細胞特異性基因CCL8表達上調(變化倍數≥2)，IL-12A基因表達下調(變化倍數≥2)。見圖3。

3 討論

呼吸道是一個復雜的黏膜組織，從鼻腔到肺泡(上呼吸道和下呼吸道)均有特定的共生菌群，在維持肺臟健康以及在呼吸系統疾病發生發展中具有重要作用[7]，腸道共生菌亦可遠端調控肺臟免疫穩態及免疫應答。肺臟內的巨噬細胞按照其所在位置分為肺泡巨噬細胞、間質內巨噬細胞及游離在肺臟血管內的巨噬細胞[8]，肺泡巨噬細胞具有F4/80+CD11c+巨噬細胞表型，是肺泡腔表面分布最為豐富的固有免疫細胞，作為機體抵御病原體和污染源的第一道防線，啟動及調控肺臟的免疫應答[2]。肺泡巨噬細胞較肺臟間質內巨噬細胞具有更強的清除微生物感染的能力，能夠產生高水平的活性氧中間體(ROI)、NO、TNF-α和細胞毒性，參與多種肺臟疾病的發生發展。共生菌對肺泡巨噬細胞的表型及功能具有重要作用，呼吸道共生菌信號調控肺泡巨噬細胞的功能和極化狀態[4,9]，腸道共生菌信號對肺泡巨噬細胞的功能亦具有重要的調控作用[10-12]，已有研究證實腸道共生菌來源的信號是建立巨噬細胞活化閾值所必不可少的免疫刺激[13]。在外部環境信號刺激下，巨噬細胞發生M1或M2型極化，M1型巨噬細胞發揮細胞毒活性和抗腫瘤活性，M2型巨噬細胞發揮免疫調節功能、促進Th2細胞活化、參與組織修復等。

本課題組前期的研究發現，共生菌缺失小鼠較正常小鼠更易發生肺部腫瘤(黑色素瘤及Leiws肺癌)，并且明確了共生菌缺失小鼠接種黑色素瘤后肺泡巨噬細胞基因表達的變化情況，但共生菌缺失對接種Leiws肺癌小鼠肺泡巨噬細胞基因表達的影響尚不明確[2,4]。本研究利用流式細胞術分選共生菌缺失荷Leiws肺癌小鼠及正常荷Leiws肺癌小鼠肺泡巨噬細胞，利用基因芯片技術篩選差異表達基因，并對差異表達基因進行生物信息學分析，結果表明，共生菌缺失荷瘤小鼠與正常荷瘤小鼠肺泡巨噬細胞之間存在353個差異表達的基因(差異倍數≥2)，上調基因171個(占48.4%)，下調基因182個(占51.6%)；M2型巨噬細胞特異性基因CCL24、Arg1、Retnla及IL-13等在共生菌缺失荷瘤小鼠肺泡巨噬細胞中表達上調(變化倍數≥2)，M1型巨噬細胞特異性基因CCL8表達上調、IL-12A基因表達下調(變化倍數≥2)。生物信息學分析結果表明，差異表達基因GO分類主要集中在細胞凋亡、趨化作用、血管生成、分泌、細胞分化、細胞增殖、對刺激的反應性、運動、信號及免疫系統過程等方面。同時，差異表達基因與氮素代謝、趨化因子信號、TGF-β信號、腫瘤、細胞因子-細胞因子受體相互作用等KEGG通路密切相關。

注：WT+LLC為共生菌正常的荷瘤小鼠；Abx+LLC為共生菌缺失的荷瘤小鼠

本研究發現共生菌可以調控荷瘤小鼠肺泡巨噬細胞中基因的表達水平，共生菌缺失導致M2型巨噬細胞特異性基因CCL24、Arg1、Retnla及IL-13等表達上調。共生菌缺失導致的差異性表達基因與細胞凋亡、趨化、血管生成、分泌、分化、增殖等GO分類及趨化因子、腫瘤等KEGG通路密切相關，上述結果為深入探討共生菌在肺泡巨噬細胞免疫穩態維持及抗腫瘤免疫應答中的作用及機制提供了重要依據和參考。