紅茶菌發酵黃漿水的體外抗氧化活性

唐思頡，涂傳海，胡文秀，董明盛*

（南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

紅茶菌也被稱為康普茶、“海寶”，是一種味道酸甜可口的純天然保健飲品[1]，對于多種胃病具有一定保健作用，在亞洲已有2 000多年的食用歷史。傳統紅茶菌制備方法為以茶糖水為基質，添加紅茶菌菌液及菌膜經自然發酵而成。最新研究表明，紅茶菌菌膜是一種液面生物膜，其中包含醋酸菌、酵母菌和少量的乳酸菌。紅茶菌的功能特性主要取決于發酵液中含有的茶葉浸出物、活的微生物及其代謝產物。由于菌種的差異性和培養方法的不同，紅茶菌的代謝途徑復雜，所得到菌液中功能成分的種類、含量也有所不同，其功能特性主要歸因于在發酵過程中產生的有機酸和酚類等抗氧化物質[2]。

黃漿水是豆腐生產過程中所產生的副產品，其中含有大量的低聚糖、大豆異黃酮及少量的蛋白質等營養物質[3]。隨著豆制品在世界范圍內產量的增加，黃漿水的排放所造成的資源浪費和環境污染備受關注。已有研究表明，經過益生菌發酵黃漿水的營養價值和功能活性有所提高，尤其是經過微生物發酵后，糖苷型的異黃酮轉化為苷元型的異黃酮，其體外抗氧化能力有所提高，微生物發酵有可能為黃漿水的利用提供新的途徑[4-6]，實現黃漿水資源的利用，減少排污，為豆制品企業帶來良好的經濟效益。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃漿水 南京市豆果果豆制品有限公司；紅茶菌發酵母液由南京農業大學食品微生物研究室保存；紅茶茶包、白砂糖 南京市蘇果超市。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2’-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）、三吡啶基三嗪（tripyridyltriazine，TPTZ）、抗壞血酸 南京雙領化玻有限公司；大豆異黃酮標準品（色譜級） 上海源葉生物科技有限公司；乙腈、三氟乙酸（色譜級） 南京大光明器化玻及供應部；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

LDZX-40AI型立式電熱壓力滅菌鍋 上海申安醫療器械廠；64RL高速冷凍離心機 美國Beckman公司；SYG-1220數顯恒溫水浴鍋 美國Crystal有限公司；AUY-120分析天平、UV-2450紫外分光光度計 日本島津公司；IS128 pH計 上海儀邁儀器科技有限公司；Synergy-2酶標儀 美國Biotek公司；UP-250-HE數控超聲波清洗器 南京壘君達超聲電子儀器設備有限公司；1100型高效液相色譜儀 美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 紅茶菌發酵液的制備

將紅茶以5 g/L添加到沸水中，煮沸5 min，加入質量分數10%白砂糖，充分溶解后過濾，待茶糖水冷卻至室溫后，按質量分數10%接入紅茶菌發酵母液，28 ℃恒溫靜置培養8 d，發酵好的紅茶菌用于后續黃漿水的發酵。

1.3.2 紅茶菌發酵黃漿水的制備

黃漿水于108 ℃滅菌15 min后冷卻至室溫。參照謝惠青[7]、Vitas[8]等的方法，在無菌環境下，按質量分數10%接入紅茶菌，28 ℃恒溫靜置培養8 d，每隔1 d無菌操作取樣，樣品經12 000 r/min離心10 min后放置于4 ℃冰箱，用于后續實驗測定。

1.3.3 pH值和總酸濃度的測定

用pH計測定發酵過程中pH值的變化；用0.1 mol/L NaOH溶液滴定發酵黃漿水，總酸濃度的計算如式（1）所示。

式中：c2為發酵黃漿水總酸濃度/（mol/L）；c1為NaOH溶液濃度/（mol/L）；V1為NaOH滴定發酵液后的體積/mL；V2為NaOH滴定發酵液前的體積/mL；V3為待測發酵液體積/mL。

1.3.4 還原糖質量濃度的測定

參照Sengupta等[9]的方法，采用3,5-二硝基水楊酸比色法測定黃漿水發酵過程中還原糖質量濃度。

1.3.5 樣品提取

參照Fei Yongtao等[10]的方法，采用體積分數80%甲醇溶液提取樣品，其中一部分提取液經0.45 μm無菌微孔濾膜過濾后用于高效液相色譜測定大豆異黃酮質量濃度；另一部分提取液經旋轉蒸發濃縮后冷凍干燥，并按實驗需要用體積分數80%甲醇溶液復溶，稀釋至不同質量濃度，用于體外抗氧化活性測定。

1.3.6 總酚和總黃酮質量濃度的測定

參照Chakravorty等[11]的方法，采用福林-酚比色法測定總酚質量濃度，以沒食子酸質量計，根據標準曲線計算?？傸S酮質量濃度的測定參照Jia Zhishen等[12]的方法，以蘆丁質量計，根據標準曲線計算。

1.3.7 大豆異黃酮組分的測定

采用高相液相色譜法測定黃漿水中大豆異黃酮質量濃度。參考Xiao Yu等[4]的實驗方法。實驗條件為：色譜柱為C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A為體積分數0.1%三氟乙酸水溶液，流動相B為乙腈；流速：0.7 mL/min；柱溫：25 ℃；檢測器：紫外檢測器；檢測波長：254 nm；進樣量：20 μL。梯度洗脫條件為：0～10 min，體積分數90%～75%流動相A；10～12 min，體積分數75%～70%流動相A；12～25 min，體積分數70%～45%流動相A；25～30 min，體積分數45%～90%流動相A。

大豆異黃酮的種類通過將未知峰與標準品在完全相同條件下的保留時間進行對比而確定。通過大豆異黃酮標準品的標準曲線計算發酵黃漿水中各大豆異黃酮的質量濃度。

1.3.8 體外抗氧化能力測定

1.3.8.1 DPPH自由基清除能力測定

參照丁艷如等[13]的方法，配制不同質量濃度的樣品及生育酚，向2 mL樣品中加入2 mL DPPH溶液（0.5 mmol/L），振蕩搖勻，在室溫下避光反應30 min，于517 nm波長處測定吸光度。DPPH自由基清除率如式（2）所示計算。

式中：ADPPH為DPPH和甲醇溶液的吸光度；Asample為DPPH和樣品溶液的吸光度；Ablank為樣品和甲醇溶液的吸光度。

1.3.8.2 ABTS陽離子自由基清除能力測定

參考Xiao Yu等[4]的方法，配制7 mmol/L ABTS溶液和2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液，按體積比1∶2混勻后置于黑暗環境16 h。使用前用乙醇稀釋ABTS溶液，使其在734 nm波長處的吸光度為0.70±0.02。配制不同質量濃度的樣品和生育酚溶液0.3 mL，加入1.2 mL ABTS溶液，在室溫下反應6 min，測定734 nm波長處的吸光度。ABTS陽離子自由基清除率如式（3）所示計算。

式中：Asample為ABTS和樣品溶液的吸光度；Acontrol為ABTS和甲醇溶液的吸光度。

1.3.8.3 亞鐵離子還原力測定

參照Xiao Yu等[14]方法，配制0.3 mol/L醋酸緩沖液（pH 3.6），用40 mmol/L HCl溶液配制濃度為10 mmol/L的TPTZ溶液和20 mmol/L FeCl3·6H2O溶液，按體積比10∶1∶1將上述溶液混勻制得亞鐵離子還原力溶液。配制不同質量濃度的樣品和生育酚溶液0.2 mL，加入1 mL亞鐵離子還原力溶液，在37 ℃下放置20 min，測定593 nm波長處的吸光度。配制梯度FeSO4標準溶液（100～1 400 μmol/L），于593 nm波長處測定吸光度，繪制標準曲線：y＝0.002 1x＋0.202 5（R2＝0.999），通過標準曲線計算亞鐵離子濃度以表示亞鐵離子還原力。

1.3.8.4 還原力測定

參照朱曉慶等[15]方法，將0.2 mL樣品、1 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.6）和1 mL質量分數1%鐵氰化鉀溶液混勻，于50 ℃反應30 min。冷卻后加入體積分數10%三氯乙酸溶液1 mL，混勻，3 000 r/min離心10 min。取1 mL上清液加入0.2 mL質量分數1%三氯化鐵溶液，混勻，靜置10 min。以蒸餾水為空白對照，于700 nm波長處測定吸光度。以樣品溶液與空白對照吸光度的差表示還原力。

1.4 數據統計與分析

2 結果與分析

2.1 黃漿水發酵過程中pH值和總酸濃度的變化

圖1 黃漿水發酵過程中pH值和總酸濃度的變化Fig. 1 Changes in pH and titratable acidity during soy whey fermentation

如圖1所示，pH值下降伴隨著總酸濃度的增加。8 d發酵期間出現兩個明顯的轉折點。第1個轉折點出現在第1天，pH值由為初始的4.89降至4.16，其后pH值穩定在4.15左右。第3天，pH值再次下降到3.28，此后pH值穩定在3.24～3.30之間。與此相反，總酸濃度持續增加至第6天，在第3～6天之間增加幅度最明顯，從0.049 mol/L增加至0.121 mol/L，在第8天略下降至0.093 mol/L。pH值下降是由于發酵過程中產生的酸所致。有研究發現，紅茶菌發酵過程中存在兩個階段，即乙醇發酵階段和醋酸發酵階段[16]。在發酵初期為乙醇發酵階段，主要由酵母發揮重要作用，酵解果糖產生乙醇和二氧化碳；此后為醋酸發酵階段，其間醋酸菌利用葡萄糖產生葡萄糖酸或葡萄糖醛酸等活性物質，并利用乙醇產生乙酸等多種有機酸，其中乙酸被公認為紅茶菌發酵過程中產生的最主要的有機酸。Jayabalan等[17]證明紅茶菌發酵液具有緩沖作用，因其產生的二氧化碳溶于水中產生HCO3－，與有機酸釋放的H＋反應，導致即使在醋酸發酵階段產生大量有機酸時pH值仍然保持穩定。

2.2 還原糖質量濃度的變化

如圖2所示，第1天還原糖質量濃度略增加，第1～3天還原糖質量濃度從9.68 mg/mL急速下降至1.37 mg/mL，此后在1.24～1.83 mg/mL之間波動。結合2.1節pH值和總酸濃度在發酵過程中的變化情況，可推斷前3 d為乙醇發酵階段，其間酵母菌為主要生長代謝的菌種，消耗了大量還原糖，并將其轉化為乙醇和二氧化碳，所產生的乙醇在發酵后期被醋酸菌迅速氧化為乙酸及其他有機酸，導致發酵液中H＋濃度升高，在酸性環境中加速蔗糖水解產生葡萄糖和果糖；同時，醋酸菌消耗水解產生還原糖，進而使發酵體系中還原糖的產生和代謝維持平衡，表現為發酵第3天之后還原糖質量濃度保持穩定。

圖2 黃漿水發酵過程中還原糖質量濃度的變化Fig. 2 Changes in reducing sugar content during soy whey fermentation

2.3 總酚和總黃酮質量濃度的變化

表1 發酵前后黃漿水體積分數80%甲醇溶液提取物中總酚和總黃酮質量濃度Table 1 Contents of total phenols and total flavonoids in 80% methanol extracts from unfermented and fermented soy whey

如表1所示，發酵黃漿水中總酚和總黃酮質量濃度都有顯著提升。黃漿水提取物中總酚質量濃度從（387.50±5.10）mg/L提高至發酵第8天的（584.80±4.63）mg/L，總黃酮質量濃度由（111.61±2.94）mg/L持續增加至發酵第6天的（268.45±2.20）mg/L。結果表明，發酵后黃漿水中新生成了酚類、黃酮類物質。許多研究表明酚類物質（包括黃酮類物質）多與蛋白、脂肪等物質相結合，以復雜且不可溶的形式存在于植物中[18]，在發酵過程中由于微生物分泌的各種酶或發酵環境酸堿度的變化等，結合酚被釋放出來[19-20]；另一方面，微生物的代謝活動也可以作用于某些生物活性物質，改變其性質，從而產生新的酚類和黃酮類化合物[21]。

2.4 大豆異黃酮質量濃度的變化

表2 4 種大豆異黃酮標準品的線性方程Table 2 Standard curves for various soybean isoflavonoids

圖3 大豆異黃酮的高效液相色譜圖Fig. 3 HPLC chromatogram of extracts rich in soybean isoflavonoids

如圖3、表2所示，本實驗測定了4 種主要的大豆異黃酮，其中黃豆黃苷和染料木苷屬于結合型的糖苷，黃豆黃素和染料木素屬于游離型的苷元。如表3所示，總體而言，在紅茶菌發酵黃漿水過程中，糖苷型異黃酮總質量濃度逐漸降低，從（86.49±1.61）mg/L減少至（47.65±3.74）mg/L，苷元型異黃酮總質量濃度提高，從（28.17±2.96）mg/L增加至（150.11±2.50）mg/L，發酵至第6天時大豆異黃酮總質量濃度比接種第0天增加約86.05 mg/L。綜合上述實驗結果，發酵至第6天的黃漿水中大豆異黃酮質量濃度達到最大值，因此確定發酵終點為第6天。

表3 發酵前后黃漿水體積分數80%甲醇溶液提取物中大豆異黃酮的質量濃度Table 3 Soybean isoflavonoids composition of 80% methanol extracts from unfermented and fermented soy whey

表3結果表明，苷元型的物質是由發酵前糖苷型的物質轉化而來。已有很多研究表明，在微生物發酵后，大豆制品中苷元型物質的含量顯著提高，這可能是由于微生物在發酵過程中產生的β-葡萄糖苷酶或是酸水解的作用，導致了苷元型物質含量的增加[22-24]；另一方面，與蛋白、脂肪等物質相結合的黃酮類物質可能在發酵前無法被檢測出，在發酵過程中逐漸被釋放，轉化成游離型的異黃酮，從而導致異黃酮總質量濃度增加[25]。由于游離型的苷元已被證實具有更高的生物活性，且更易被人體小腸吸收利用[26]。因此，黃漿水可作為紅茶菌的一種新型發酵基質，從而為其賦予更高的營養價值。

2.5 發酵黃漿水的抗氧化活性

如圖4A所示，與未發酵黃漿水相比，發酵黃漿水對DPPH自由基的清除能力明顯提高，在樣品質量濃度為0.25～10 mg/mL時，未發酵黃漿水的DPPH自由基清除率從5.22%提高至58.25%，而發酵黃漿水則從15.19%提高至93.19%。結果表明，發酵過程對提高DPPH自由基清除能力起著重要作用。Marazza等[27]利用鼠李糖乳桿菌發酵豆漿，發現發酵豆漿內苷元型異黃酮質量濃度增加，導致DPPH自由基清除率也隨之增加；苷元型異黃酮相較于其對應的β-葡萄糖苷型前體具有更高的抗氧化活性。因此，推測苷元型大豆異黃酮質量濃度的提高是DPPH自由基清除率提高的重要原因。

如圖4B所示，未發酵黃漿水和發酵黃漿水的ABTS陽離子自由基清除能力在0.25～4 mg/mL之間明顯提高。當質量濃度超過4 mg/mL時，兩者對ABTS陽離子自由基的清除能力分別維持在55%和80%左右。Dani等[28]認為酚類化合物的抗氧化能力具有濃度飽和上限，這意味著當濃度超過飽和上限的時候，酚類化合物對ABTS陽離子自由基的清除能力不再增加。

如圖4C所示，未發酵黃漿水和發酵黃漿水的亞鐵離子還原力與樣品質量濃度成正比。發酵黃漿水的亞鐵離子濃度從7.70 μmol/L增加至681.03 μmol/L，而未發酵黃漿水僅從15.37 μmol/L增加至253.24 μmol/L，可以看出經過發酵的黃漿水明顯增強了亞鐵離子還原力。

從圖4D可知，隨著質量濃度的增加，未發酵黃漿水和發酵黃漿水的還原力均增強。4～10 mg/mL時，發酵黃漿水的還原力明顯強于未發酵黃漿水。在6 mg/mL下，未發酵黃漿水的還原力為0.08，而發酵黃漿水為0.27，是未發酵黃漿水的3.4 倍。研究表明，發酵過程中微生物產生的一些還原酮物質可以向自由基提供電子而使其更加穩定，進而有利于終止自由基鏈式反應的進行[29]，因此發酵后的黃漿水具有更強的還原力。

圖4 發酵前后黃漿水體積分數80%甲醇溶液提取物體外抗氧化活性Fig. 4 In vitro antioxidant activity of 80% methanol extracts from unfermented and fermented soy whey

事實上，紅茶菌發酵體系復雜，發酵液抗氧化活性的提高取決于多種因素，在發酵過程中，存在多種次級代謝產物，包括葡萄糖酸和葡萄糖醛酸。已有研究證明這些物質具有鈣離子和鐵離子螯合劑的特性[30]。除此之外，發酵過程中的一些物理化學變化也會給黃漿水發酵產物的抗氧化活性帶來一定的影響[31-32]。

黃漿水的抗氧化活性與其EC50成反比。發酵黃漿水的DPPH自由基清除力、ABTS陽離子自由基清除力和還原力的EC50分別為1.660、1.306、11.339 mg/mL，顯著低于未發酵黃漿水（分別為9.108、4.584、821.722 mg/mL）（P＜0.05）。上述結果表明，利用紅茶菌發酵黃漿水可明顯提高其抗氧化活性。

3 結 論

本研究以紅茶菌為菌種、以黃漿水為基質進行發酵，得到具有功能活性的新型黃漿水發酵產品。本研究結果可支持一種改善營養價值和功能特性的紅茶菌發酵飲品的開發。經發酵后的黃漿水營養和功能特性相比未發酵黃漿水明顯提高。相比于未發酵黃漿水，發酵至第6天黃漿水中的游離型苷元質量濃度增加至（150.95±0.79）mg/L，是未發酵黃漿水的5.3 倍；黃豆黃素質量濃度從（9.69±1.32）mg/L增加至（77.61±1.72）mg/L；染料木素質量濃度從（18.49±1.67）mg/L增加至（73.34±1.46）mg/L。經紅茶菌發酵后的黃漿水抗氧化活性明顯提高。本研究結果表明，苷元型大豆異黃酮質量濃度的增加是發酵黃漿水抗氧化活性提高的重要原因。