米糠酸敗對米糠蛋白體外胃蛋白酶消化產物結構特征的影響

吳 偉，何莉媛，黃慧敏，吳曉娟*，林親錄

（中南林業科技大學食品科學與工程學院，稻谷及副產物深加工國家工程實驗室，湖南 長沙 410004）

米糠是稻谷加工過程中最重要的一類副產物，雖然只占稻谷質量的6%～8%，但卻集中了稻谷中60%～70%的營養素，包括豐富的脂質、蛋白質等[1]。然而，米糠極易酸敗，導致米糠及其制品營養品質下降[2]。長期以來，關于米糠酸敗影響米糠制品營養品質的研究主要圍繞米糠油展開，而忽略了米糠蛋白營養品質的變化[3]。米糠蛋白在脫脂米糠中質量占比達15%～20%，米糠蛋白致敏性低、氨基酸組成合理、生物效價高，是一種極具開發潛力的新型植物蛋白，特別適合開發嬰幼兒配方食品[4]。近期有研究表明，米糠氧化酸敗產物可導致米糠蛋白氧化，使得米糠蛋白結構特征和功能性質發生改變[5]。隨著米糠酸敗程度的增加，米糠蛋白體外胃蛋白酶消化產物的抗氧化性也會發生顯著變化[6]。蛋白質消化產物往往直接被機體吸收與利用，蛋白質消化產物抗氧化性的改變勢必影響機體氧化還原狀態，從而可能誘發機體氧化應激[7-8]。為全面評價和控制米糠酸敗對米糠蛋白營養品質的影響，研究米糠酸敗影響米糠蛋白消化產物抗氧化性的機理尤為重要，而蛋白質消化產物的抗氧化性與其結構特征（分子質量大小、表面疏水性等）密切相關[9-11]。因此，有必要對米糠酸敗過程中米糠蛋白消化產物結構特征的變化進行深入分析。本研究以新鮮米糠為原料，在室溫下貯藏一定時間得到不同酸敗程度的米糠，經過穩定化和脫脂處理后制備米糠蛋白，研究米糠酸敗對米糠蛋白體外胃蛋白酶消化產物結構特征的影響，以期為開發米糠蛋白及相關健康食品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮米糠（酸值3 mg/g） 湖南糧食集團有限責任公司；胃蛋白酶（800 U/mg） 合肥Biosharp公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、丙烯酰胺、N,N’-甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨 美國Sigma公司；標準分子質量蛋白 北京全式金生物技術有限公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris）、β-巰基乙醇、乙酸等（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

RXZ-128A型人工氣候箱 寧波市科技園區新江南儀器有限公司；FMHE36-24型雙螺桿擠壓機 湖南富馬科食品工程技術有限公司；Sorvall LYNX6000型冷凍離心機 美國Thermo Fisher公司；FD5-4T型冷凍干燥機金西盟（北京）儀器有限公司；DSI Z-300A型水浴恒溫振蕩器 蘇州培英實驗設備有限公司；Nano ZS型納米粒度分析儀 英國Malvern公司；F-4600型熒光分光光度計 日本日立公司；LC-20A型高效液相色譜儀日本島津公司；SE260型電泳儀 美國GE公司。

1.3 方法

1.3.1 新鮮米糠貯藏不同時間制備不同酸敗程度的米糠

參考何莉媛等[6]的方法，以新鮮米糠為原料粉碎過40 目篩，在室溫下分別貯藏0、1、3、5、10 d得到不同酸敗程度的米糠，采用雙螺桿擠壓機進行穩定化處理。穩定化條件為：進料量15 kg/h，控制水分質量分數16%，雙螺桿擠壓機2～6區溫度依次為70、120、120、70 ℃和60 ℃。然后，將穩定化處理的米糠與正己烷按料液比1∶4（m/V）混合脫脂，收集米糠毛油，所得米糠毛油酸值分別為3、16、26、35、40 mg/g。最后，將濾餅置于通風櫥中風干后得到脫脂米糠，將脫脂米糠置于4 ℃冰箱保存備用。

1.3.2 米糠蛋白的制備

參考吳偉等[5]的方法，將脫脂米糠與去離子水按1∶10（m/V）混合，用2 mol/L NaOH溶液調pH值至9.0，40 ℃下攪拌反應4 h。將懸浮液在4℃、8 000 r/min離心15 min，取上清液用2 mol/L HCl溶液調pH值至4.0，靜置30 min后在4 ℃、8 000 r/min離心15 min得到米糠蛋白沉淀。水洗沉淀3 次，再將其分散于去離子水中，用2 mol/L NaOH溶液調pH值至7.0，冷凍干燥得到米糠蛋白。

1.3.3 米糠蛋白體外胃蛋白酶消化樣品的制備

參考Chen Nannan等[12]的方法，分別將不同貯藏時間米糠制備的米糠蛋白用去離子水配制成質量分數2%的米糠蛋白懸浮液，將懸浮液置于37 ℃水浴30 min，并用2 mol/L HCl溶液調pH值至2.0。然后，分別加入4 U/mg胃蛋白酶，在37 ℃進行體外消化反應。消化0、5、10、20、30、40、60 min和90 min后取樣，用2 mol/L NaOH溶液將消化不同時間的米糠蛋白懸浮液調pH值至7.0，終止消化后對所得樣液進行冷凍干燥，于4 ℃冰箱保存備用。

1.3.4 米糠蛋白消化產物亞基結構的測定

參考吳偉等[5]的方法，采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法。樣品質量濃度為3 mg/mL，上樣量為12 μL，分離膠和濃縮膠質量分數分別為12.5%和4%，電極緩沖液含0.05 mol/L Tris、0.384 mol/L甘氨酸、0.1% SDS（pH 8.3），樣品溶解液含SDS 2 g/100 mL、β-巰基乙醇5 g/100 mL、甘油10 g/100 mL、溴酚藍0.02 g/100 mL、0.01 mol/L pH 8.0 Tris-HCl緩沖液。固定液為454 mL體積分數50%甲醇溶液與46 mL冰乙酸混合液，染色液為考馬斯亮藍R-250，脫色液為體積分數95%乙酸溶液。電泳前期的電流為10 mA，待樣品進入分離膠改為25 mA。

1.3.5 米糠蛋白消化產物分子質量分布的測定

參考Chen Nannan等[12]的方法，用高效液相色譜儀測定米糠蛋白消化產物的分子質量分布。將米糠蛋白消化產物（1.0 mg/mL）用磁力攪拌器攪拌2 h，4 ℃、10 000 r/min離心20 min，取上清液用0.45 μm醋酸纖維素膜過濾備用。色譜柱：TSKgel SW G2000 SWXL（300 mm×7.8 mm，5 μm）；檢測器：Waters 996光電二極管陣列檢測器；流動相：0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.8，含0.1 mol/L Na2SO4）；紫外檢測波長：214 nm；流速：0.5 mL/min；柱溫：25 ℃。蛋白質標準曲線所用5 種標準品：細胞色素C（12 384 u)、抑肽酶（6 511 u)、桿菌肽（1 450 u）、氧化型谷胱甘肽（651 u)、Gly-Gly-Tyr-Arg（451 u）、Gly-Gly-Gly（189 u），蛋白質標準曲線為lg Y＝－0.237 1X＋7.157 7（R2＝0.985 6），其中Y為蛋白質相對分子質量，X為保留時間/min。

1.3.6 米糠蛋白消化產物粒徑分布的測定

參考吳偉等[5]的方法，采用納米粒度分析儀測定米糠蛋白消化產物的粒徑分布，樣品質量濃度為0.25 mg/mL。

1.3.7 米糠蛋白消化產物熒光峰位的測定

參考Wu Wei等[13]的方法，用考馬斯亮藍法測定米糠蛋白消化產物的蛋白質量濃度，將其稀釋至0.1 mg/mL，并用F-4600型熒光分光光度計在激發波長280 nm處得到300～500 nm波長之間的發射光譜。

1.3.8 米糠蛋白消化產物表面疏水性的測定

參考Huang Youru等[14]的方法，采用ANS熒光探針法測定米糠蛋白消化產物的表面疏水性。稀釋蛋白質量濃度梯度為0.005、0.01、0.02、0.05、0.08 mg/mL和0.10 mg/mL；激發波長和發射波長分別為384 nm和471 nm，靈敏度為6。以熒光強度對樣品質量濃度作圖，外推至蛋白質質量濃度為0，曲線初始階段的斜率即為米糠蛋白消化產物的表面疏水性指數。

1.4 數據處理與分析

所有實驗平行測定3 次。數據采用Microsoft Excel 2003和Origin 7.5軟件進行處理，結果以表示，指標比較采用最小顯著差異法，取95%置信度（P＜0.05）。采用Origin 7.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 米糠酸敗對米糠蛋白消化產物亞基結構的影響

圖1 米糠酸敗對米糠蛋白體外胃蛋白酶消化產物亞基結構的影響Fig. 1 Effect of rice bran rancidity on subunit structures of in vitro pepsin digest of rice bran protein

米糠蛋白是一種混合蛋白，包含清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白，其亞基結構十分復雜，米糠清蛋白主要以高分子質量亞基為主，米糠球蛋白既有高分子質量亞基也有低分子質量亞基，米糠谷蛋白和米糠醇溶蛋白則以低分子質量亞基為主[15-16]。在體外胃蛋白酶消化過程中，隨著胃蛋白酶消化時間延長，高分子質量亞基和低分子質量亞基均發生了不同程度的降解。從圖1A可以看出，米糠清蛋白亞基（60～80 ku）和米糠谷蛋白酸性亞基（37 ku左右）最先被胃蛋白酶完全消化降解，酶解10 min左右，二者對應的亞基條帶均已消失；隨后米糠谷蛋白堿性亞基（20 ku左右）和米糠球蛋白亞基（20～30、40～60 ku）也逐漸被胃蛋白酶消化降解；而米糠醇溶蛋白亞基（7～14 ku）對應的電泳條帶則先變寬后變窄。這表明，米糠谷蛋白酸性亞基比堿性亞基容易被胃蛋白酶消化，親水性亞基比疏水性亞基容易被胃蛋白酶消化。江連洲等[17]關于體外胃蛋白酶消化大豆蛋白的研究也發現，大豆球蛋白中酸性亞基比堿性亞基容易被胃蛋白酶降解，β-伴大豆球蛋白中帶有較強親水性“肽鏈”的α-亞基，比具有疏水性“核心”的β-亞基容易被胃蛋白酶降解。體外胃蛋白酶消化過程中，隨著米糠酸敗程度加劇，米糠清蛋白亞基、谷蛋白酸性亞基和球蛋白亞基完全降解的時間先推前后延遲，米糠貯藏3 d制備的米糠蛋白最容易被消化，消化時間30 min時，這些亞基對應的電泳條帶基本都已消失（圖1C）。而米糠酸敗過程中，米糠谷蛋白堿性亞基和醇溶蛋白亞基則總體上表現為越來越難被胃蛋白酶消化，米糠貯藏10 d制備的米糠蛋白被消化90 min時，這兩種亞基對應的電泳條帶依然存在（圖1E）。關于米糠酸敗對米糠蛋白體外胃蛋白消化進程影響的研究也表明，米糠貯藏3 d制備的米糠蛋白初始消化速率最大，而米糠貯藏10 d制備的米糠蛋白初始消化速率最小[6]。這可能是由于米糠貯藏3 d時酸敗程度較低，產生的米糠氧化酸敗產物可誘導蛋白質分子部分去折疊，空間結構柔性增加，暴露出更多的胃蛋白酶酶解位點，使蛋白質容易被消化[18]。隨著米糠貯藏時間的延長，米糠氧化酸敗程度快速增加，產生大量的脂質自由基和活性脂質氧化產物[19]。關于蛋白質氧化的大量研究已證實，過量的過氧自由基[20]、丙二醛[21]等均會誘導蛋白質氧化形成共價交聯聚集體。圖1E也顯示，米糠貯藏10 d制備的米糠蛋白形成了大量共價交聯聚集體，隨著消化時間延長，蛋白質聚集體被降解成與天然亞基分子質量大小類似的亞基，但是這些亞基的空間結構在去折疊-聚集-酶解的過程中發生了改變，可能使米糠蛋白氧化初期暴露的胃蛋白酶酶解位點被掩蔽，從而難以被胃蛋白酶消化降解。

2.2 米糠酸敗對米糠蛋白消化產物分子質量分布的影響

體外胃蛋白酶消化過程中，蛋白質分子通常先降解成?和胨，再水解為小分子肽，其分子質量變化是一個動態過程[22]。如表1所示，隨著胃蛋白酶消化時間的延長，米糠蛋白消化產物中大于10 ku的組分均急劇減少，3～10 ku的組分均先增加后減少，而小于3 ku的組分則均持續增加。蛋白酶一般具有較廣泛的作用位點，然而胃蛋白酶是專一性較強的蛋白酶，通常被認為不易將蛋白質水解成小分子肽[23]。Chen Nannan等[24]采用胃蛋白酶水解天然大豆蛋白1 h得到的消化產物中小于3 ku的蛋白肽僅為19.64%，遠低于同等條件下本實驗制備的米糠蛋白消化產物（44.05%～50.04%）。這表明，相比于大豆蛋白，米糠蛋白易于被胃蛋白酶消化降解成小分子肽，并且有文獻報道，這些小分子肽是米糠蛋白消化產物具有抗氧化活性的關鍵組分[9-10]。

表1 米糠酸敗對米糠蛋白體外胃蛋白酶消化產物分子量分布的影響Table 1 Effect of rice bran rancidity on molecular mass distribution of in vitro pepsin digest of rice bran protein

從表1還可以看出，未水解的米糠蛋白分子質量主要集中在10 ku以上，占比達84%以上。隨著米糠貯藏時間的延長，未水解的米糠蛋白大于10 ku和小于3 ku的組分均略微增加，而3～10 ku的組分則有所減少。結合前面的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖分析，大于10 ku組分增加的原因應該是米糠脂質酸敗氧化產物誘導蛋白質氧化形成了可溶性的聚集體，并且吳偉等[5]關于米糠酸敗對米糠蛋白結構影響的研究已證實，形成的主要是大于1 000 ku的高分子質量聚集體。小于3 ku組分也增加可能是因為部分米糠脂質酸敗氧化產物如過氧自由基等，不僅可誘導蛋白質氧化聚集，同時還可切斷蛋白質主肽鏈，形成分子質量較小的肽類物質[25]。有關大豆蛋白[26]和豬肌原纖維蛋白[27]的氧化研究也發現，較高濃度的脂質過氧化產物可誘導蛋白質組分部分降解。酶解90 min時得到的米糠蛋白消化產物的分子質量分布則顯示，分子質量主要集中在1 ku以下，占比達55%以上。隨著米糠貯藏時間的延長，酶解90 min時得到的米糠蛋白消化產物中大于10 ku的組分占比增加，而小于3 ku的多肽占比變小，這同樣表明，米糠酸敗過程中米糠蛋白形成的氧化聚集體難以被胃蛋白酶降解成小分子肽。

2.3 米糠酸敗對米糠蛋白消化產物粒徑分布的影響

圖2 米糠酸敗對米糠蛋白體外胃蛋白酶消化產物粒徑分布的影響Fig. 2 Effect of rice bran rancidity on particle size distribution of in vitro pepsin digest o rice bran protein

米糠蛋白消化產物的粒徑分布如圖2所示，隨著胃蛋白酶消化時間延長，不同酸敗程度米糠制備的米糠蛋白消化產物的粒徑分布均先往大尺寸方向偏移，再往小尺寸方向偏移，在消化30 min時粒徑分布曲線位于最大尺寸處。平均粒徑結果也顯示，隨著消化時間延長，5 組貯藏不同時間米糠制備的米糠蛋白消化產物平均粒徑均先增加后減?。▓D3）。Cui Chun等[28]關于不同pH值條件下胃蛋白酶消化大豆蛋白的研究同樣發現，隨著胃蛋白酶消化時間的延長，大豆蛋白消化產物的平均粒徑先增大后減小，并認為消化前期粒徑增大的原因是胃蛋白酶水解誘導大豆球蛋白去折疊形成了大的可溶性聚集體，消化后期粒徑減小的原因是聚集體逐漸降解為低分子質量肽。結合前面分子質量分布的結果可以推斷，隨著消化時間進一步延長，米糠蛋白消化產物粒徑減小的原因也是由于形成了較多的低分子質量肽。

圖3 米糠酸敗對米糠蛋白體外胃蛋白酶消化產物平均粒徑的影響Fig. 3 Effect of rice bran rancidity on average particle size of in vitro pepsin digest of rice bran protein

體外胃蛋白酶消化過程中，隨著米糠貯藏時間的延長，米糠蛋白消化產物的粒徑分布曲線由單峰分布（圖2A）逐漸變成雙峰分布（圖2B～E），且在100～1 000 nm之間峰所占體積分數逐漸增加。平均粒徑結果顯示，當消化時間相同時，隨著米糠貯藏時間延長，米糠蛋白消化產物的平均粒徑越大（圖3）。吳偉等[5]關于米糠酸敗對米糠蛋白結構影響的研究已證實，隨著米糠貯藏時間的延長，米糠蛋白粒徑增加是由于可溶性聚集體的形成。米糠蛋白消化產物的粒徑分布結果進一步表明，米糠酸敗可導致米糠蛋白形成氧化聚集體，且這類氧化聚集體難以被胃蛋白酶消化分解。

2.4 米糠酸敗對米糠蛋白消化產物內源熒光光譜峰位的影響

圖4 米糠酸敗對米糠蛋白體外胃蛋白酶消化產物內源熒光光譜峰位的影響Fig. 4 Effect of rice bran rancidity on maximum emission wavelength in intrinsic fluorescence spectra of in vitro pepsin digest of rice bran protein

蛋白質內源熒光光譜主要反映蛋白質芳香族氨基酸殘基及其微環境的變化[29-30]。米糠蛋白消化產物的熒光峰位與消化時間關系曲線如圖4所示，隨著體外胃蛋白酶消化時間延長，5 組貯藏不同時間米糠制備的米糠蛋白消化產物熒光峰位均發生紅移。這可能是由于胃蛋白酶具有一定的氨基酸序列選擇特異性，優先斷裂由芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸）或亮氨酸形成的肽鍵，隨著消化時間延長，大量芳香族氨基酸從蛋白質內部的疏水性中心轉移到外部的親水性環境中[23]。Cui Chun等[28]關于不同pH值條件下胃蛋白酶消化大豆蛋白的研究也發現，隨著消化時間延長，大豆蛋白熒光峰位發生紅移，同樣認為是由于芳香族氨基酸殘基的微環境由疏水環境轉變成了親水環境。隨著米糠貯藏時間的延長，米糠蛋白消化產物的紅移幅度先增大后減小，在第3天時紅移幅度最大。何莉媛等[6]在研究米糠酸敗對米糠蛋白體外胃蛋白酶消化性質的影響時發現，隨著米糠貯藏時間延長，米糠蛋白消化率和消化速率均呈現先上升后下降的趨勢，也在米糠貯藏3 d 時達到最大值。由此推測，當米糠酸敗程度較低時，米糠蛋白發生適度氧化，有利于蛋白質分子在胃蛋白酶消化過程中結構展開，使更多內部的芳香族氨基酸殘基暴露于親水環境中，使得熒光峰位紅移幅度增加；當米糠酸敗程度較高時，米糠蛋白過度氧化形成的共價交聯聚集體使得胃蛋白酶作用位點減少，不利于內部的芳香族氨基酸殘基被水解，使得熒光峰位紅移幅度減小。

2.5 米糠酸敗對米糠蛋白消化產物表面疏水性的影響

圖5 米糠酸敗對米糠蛋白體外胃蛋白酶消化產物表面疏水性的影響Fig. 5 Effect of rice bran rancidity on surface hydrophobicity of in vitro pepsin digest of rice bran protein

表面疏水性是指在極性溶液中蛋白質分子表面疏水性氨基酸的相對含量，被作為評價蛋白質結構變化的重要參數[18]。米糠蛋白消化產物的表面疏水性如圖5所示，隨著體外胃蛋白酶消化時間延長，5 組貯藏不同時間米糠制備的米糠蛋白消化產物的表面疏水性均先上升后下降，在消化20 min左右達到最大值。Cui Chun等[28]關于大豆蛋白胃蛋白酶消化的研究也發現，隨著消化時間延長，消化產物的表面疏水性先上升后下降。Radha等[31]研究發現，采用蛋白酶水解20 min得到的大豆蛋白酶解產物的表面疏水性相比于未改性的大豆蛋白顯著增加，歸因于酶解促使掩埋于大豆球蛋白分子內部的疏水性基團暴露到外部親水性環境中。Bamdad等[32]則發現，當水解時間超過30 min時，大麥醇溶蛋白消化產物的表面疏水性逐漸下降，歸因于醇溶蛋白分子內部掩埋了更多親水性基團，酶解誘導其內部的親水性基團暴露于外部。結合前面米糠蛋白消化產物的電泳圖分析，消化過程中表面疏水性先升后降的原因是：消化初期，胃蛋白酶首先降解米糠清蛋白、球蛋白等親水性亞基，使內部的疏水性基團暴露；消化后期，米糠醇溶蛋白也逐漸被水解，誘導其內部的親水性基團暴露。此外，暴露的疏水性基團通過疏水相互作用聚集也會導致表面疏水性下降[28]。隨著米糠貯藏時間越長，米糠蛋白及其消化產物的表面疏水性均越來越小。吳偉等[5]認為米糠酸敗導致米糠蛋白表面疏水性下降的主要原因，一是酸敗過程產生的脂質氧化產物與米糠蛋白的疏水基團發生了反應，二是進一步通過疏水相互作用形成了氧化聚集體。這可能也是造成米糠蛋白胃蛋白酶消化產物的表面疏水性隨著米糠酸敗程度增加不斷下降的原因。

3 結 論

將新鮮米糠貯藏一定時間得到不同酸敗程度的米糠，隨后脫脂制備米糠蛋白，研究米糠酸敗過程中米糠蛋白體外胃蛋白酶消化產物結構特征的變化。電泳分析顯示，在體外胃蛋白酶消化過程中，新鮮米糠的清蛋白亞基和谷蛋白酸性亞基最先被胃蛋白酶完全消化降解，隨后谷蛋白堿性亞基和球蛋白亞基也逐漸被胃蛋白酶消化降解，而醇溶蛋白亞基則最后被胃蛋白酶作用。隨著米糠酸敗程度加劇，清蛋白亞基、谷蛋白酸性亞基和球蛋白亞基完全降解的時間先提前后延遲，貯藏3 d米糠制備的米糠蛋白消化產物的亞基條帶消失最早，而谷蛋白堿性亞基和醇溶蛋白亞基則總體上表現為更難以被胃蛋白酶消化。通過分子質量分布和粒徑分布結果可以看出，米糠酸敗過程中米糠蛋白形成了大量共價交聯聚集體，且這類氧化聚集體難以被胃蛋白酶消化分解。蛋白質內源熒光峰位結果顯示，隨著體外胃蛋白酶消化時間延長，米糠蛋白消化產物熒光峰位均發生紅移，隨著米糠酸敗程度增加，米糠蛋白消化產物的紅移幅度先增大后減小，在第3天時紅移幅度最大。表面疏水性結果顯示，隨著體外胃蛋白酶消化時間延長，米糠蛋白消化產物的表面疏水性均先上升后下降，在消化20 min左右達到最大值，米糠酸敗則會導致米糠蛋白及其消化產物的表面疏水性均下降，這表明米糠酸敗對米糠蛋白消化產物中芳香族氨基酸殘基和疏水性氨基酸殘基的組成、分布及其微環境也產生了重要影響。