兩種飼養方式下蘇尼特羊肉的氧化穩定性

羅玉龍，劉 暢，李文博，王柏輝，竇 露，杜 瑞，要 鐸，趙麗華，蘇 琳，靳 燁*

（內蒙古農業大學食品科學與工程學院，內蒙古 呼和浩特 010018）

在肌肉組織中，氧化穩定性是由脂質氧化與抗氧化能力共同決定的。脂質氧化主要是脂肪酸發生鏈式反應并產生一系列代謝產物，包括醛、酮、醇、烴等，在大多數情況下，脂質過度氧化會產生令人不愉悅的氣味[1-2]。同時，肉中存在的抗氧化系統能抑制氧化，使肉質氧化達到平衡；不合理的飼養方式會使機體過度氧化，加快蘇尼特羊的衰老，使羊肉的質量下降。肉中的抗氧化系統主要包括抗氧化酶系統與非酶系統：抗氧化酶系統以超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidases，GPx）為主；非酶系統指的是肌肉組織中的生育酚、類胡蘿卜素、酚類化合物等抗氧化物質[3]。但當氧化平衡被破壞后，肉品會加速氧化并引起品質劣變，其貨架期會大幅縮短[4]。目前有關抗氧化系統的研究已有報道，但對肉中脂質氧化產物的研究還比較少。Descalzo等發現肉中抗氧化系統由維生素、酚類物質、抗氧化酶等組成，這些物質能清除脂質氧化形成的自由基，達到抑制脂質氧化的作用[5]。Luciano等發現在肉羊飼料中添加單寧后，羊肉的抗氧化能力得到了明顯提升[6]。Ponnampalam等發現牧草中的VE能抑制放牧飼養羊肉中的脂質過度氧化[7]。但以上學者對羊肉的氧化穩定性鮮有系統、全面的研究，本團隊也僅對絨山羊肉的抗氧化系統進行了一定的研究[8]。因此，本實驗通過對放牧飼養和舍飼飼養蘇尼特羊肉的脂質氧化產物含量、抗氧化能力、抗氧化酶活力以及相關調控基因表達量進行測定，對比兩種飼養方式對蘇尼特羊肉氧化穩定性的影響；同時，分析脂質氧化產物含量與抗氧化能力之間的聯系，為蘇尼特羊的科學化飼養提供一定的理論依據和指導方向。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從烏拉特中旗畜牧業育種園區內隨機選取發育正常、健康無病的放牧飼養和舍飼飼養蘇尼特羊各12 只（公母各6 只）。放牧飼養羊主要攝食牧草（包括中間錦雞兒、芨芨草、蒙古蔥、堿韭等）；舍飼飼養羊則以攝食飼草料（包括玉米秸稈、葵盤粉等）為主，并補充玉米精料及育肥飼料。

甲醇、氯仿、三氯乙酸（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；CAT試劑盒、SOD試劑盒、GPx試劑盒、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、總蛋白定量試劑盒 南京建成生物工程研究所；2,2’-聯氮基-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt，ABTS） 美國Amresco公司；焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC） 美國賽默飛世爾科技公司；RNAiso Plus、6×loading buffer、Marker DL2000、Premix Taq?Version 2.0、PremeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR?Premix Ex TaqTM大連寶生物工程有限公司。

1.2 儀器與設備

Trace 1300型氣相色譜（gas chromatography，GC）儀、ISQ型質譜（mass spectrometer，MS）儀、固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）手柄 美國賽默飛世爾科技公司；SPME萃取頭 美國Supelco公司；5810-R型低溫臺式冷凍離心機 德國Eppendorf公司；BG-power 5000型穩壓穩流電泳儀 北京百晶生物科技有限公司；水平電泳槽、凝膠成像分析儀、CFX96TM型實時定量聚合酶鏈式反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）儀 美國Bio-Rad公司；普通PCR儀 美國Applied Biosystems公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

實驗羊宰前禁食并停止飲水，屠宰后從每只羊的股二頭肌取約15 g肌肉，置于無菌無酶凍存管中于液氮中存放，于－80 ℃冰箱中保存待用。

1.3.2 脂質氧化產物含量的測定

肉樣前處理：將肉樣解凍后去筋膜，切塊并用液氮速凍，用粉碎機粉碎，稱取5 g粉碎肉樣放入20 mL樣品瓶中，再將老化過的萃取頭插入樣品瓶，距離樣品1 cm，60 ℃水浴吸附40 min后取出萃取頭，插入GC進樣口，在250 ℃下解吸4 min。

GC-MS條件[9]：TR-5色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），載氣為He；載氣流速1.0 mL/min；進樣口、離子源和傳輸線溫度均為250 ℃；進樣方式：不分流進樣；升溫程序：40 ℃保持3 min；以4 ℃/min升至150 ℃，保持1 min；再以5 ℃/min升溫至200 ℃，以20 ℃/min升至230 ℃，保持5 min；質量掃描范圍m/z30～400；溶劑延遲時間1 min。MS數據經MEANLIB、NISTDEMO和Wiley Library軟件檢索，取正反匹配度大于800數據。用峰面積表示蘇尼特羊肉中脂質氧化產物含量（106AU/g）。

1.3.3 硫代巴比妥酸值、抗氧化酶活力和T-AOC的測定

肉樣4 ℃解凍后用預冷的生理鹽水漂洗，稱取0.5 g，加9 倍體積生理鹽水，在冰水浴中8 000 r/min勻漿30 s，制成質量分數10%組織勻漿液，4 ℃、4 000 r/min離心10 min，取上清液，并按照試劑盒說明書分別測定上清液中蛋白含量、SOD活力、GPx活力、CAT活力、硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）值以及T-AOC。

1.3.4 自由基清除率的測定

自由基清除率（radical scavenging ability，RSA）的測定參照文獻[10]的方法。將25 mL 14 mmol/L ABTS溶液與等體積的2.45 mmol/L K2S2O8溶液混合，黑暗條件下反應16 h，使ABTS完全氧化而形成ABTS陽離子自由基反應液。稀釋ABTS陽離子自由基反應液，使其在734 nm波長處的吸光度為0.750±0.020。取1.3.3節組織提取液50 μL與6 mL ABTS陽離子自由基反應液混合，30 ℃水浴反應6 min后在734 nm波長處測吸光度。用等體積的去離子水代替組織提取液作為空白，RSA按下式計算。

式中：A0為空白組吸光度；A1為樣品組吸光度。

1.3.5 銅離子還原能力的測定

參照Apak等[11]的方法測定銅離子還原能力（cupric reducing antioxidant capacity，CUPRAC），將50 μL 1.3.3節組織提取液的上清液加入到反應體系（1 mL 10 mmol/L氯化銅溶液、1 mL 1 mol/L乙酸銨溶液、1 mL 7.5 mmol/L新銅溶液（溶劑為體積分數96%乙醇溶液））中，室溫反應1 h，在450 nm波長處測吸光度。同時，用等體積的蒸餾水代替肌肉提取物作為空白對照，CUPRAC以抗壞血酸質量計。

1.3.6 基因表達量的測定

1.3.6.1 引物與探針

引物序列如表1所示，由上海生工生物工程有限公司設計并合成，以18S rRNA作為內參基因。

表1 qPCR引物Table 1 Primers used for real-time polymerase chain reaction

1.3.6.2 總RNA的提取與反轉錄

稱取約100 mg肉樣，參照文獻[12]中方法進行RNA的提取。測定RNA的吸光度（A260nm/A280nm）及質量濃度后，用質量分數1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量。將RNA樣品稀釋至500 ng/μL，參照反轉錄試劑盒說明書的兩步法進行反轉錄，將得到的cDNA放入－20 ℃冰箱內保存。

1.3.6.3 qPCR分析

以c D N A為模板，S Y B R為熒光染料，按照CFX96TMReal-Time PCR Detection System的二步法操作。PCR體系：12.5 μL SYBR?Premix ExTaqTMII、1.0 μL引物F、1.0 μL引物R、2.0 μL cDNA模板、8.5 μL RNase Free dH2O。PCR程序為：預變性95 ℃、30 s；變性95 ℃、5 s，退火60 ℃、30 s，延伸72 ℃、30 s，共35 個循環；延伸72 ℃、10 min。采用2－ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

1.4 數據統計與分析

數據用SPSS 20.0軟件進行方差分析，組間顯著性檢驗用Duncan’s法多重比較，數據用平均值±標準差表示，用Excel軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 氧化指標分析結果

2.1.1 不同飼養方式蘇尼特羊肉中脂質氧化程度

羊肉在宰后成熟過程中極易被氧化而產生一些代謝產物，這不僅能引起羊肉的劣變，還能加速肉中肌紅蛋白的氧化，造成肉色變差，通常用TBA值反映肉的脂質氧化程度[13-14]。舍飼飼養蘇尼特羊肉的TBA值高度顯著高于放牧飼養（P＜0.001），達到6.10 U/mg，這表明舍飼飼養蘇尼特羊肉的脂質氧化程度更嚴重。放牧飼養羊肉的TBA值（1.37 U/mg）較低，這是由于放牧飼養羊長期攝食大量的綠色牧草，而牧草中含有豐富的抗氧化物質，能夠清除組織內的自由基，有效阻止脂質氧化，從而使得放牧飼養羊肉的脂質氧化程度較低[15]。

2.1.2 不同飼養方式蘇尼特羊肉脂質氧化產物比較

圖1 舍飼飼養蘇尼特羊肉脂質氧化產物的GC-MS圖Fig. 1 Gas chromatography-mass spectrometric (GC-MS) profile of lipid oxidation products in meat from forage plus concentrate-fed sheep

圖2 放牧飼養蘇尼特羊肉脂質氧化產物的GC-MS圖Fig. 2 GC-MS analysis of lipid oxidation products in meat from grazed sheep

由圖1、2可知，共檢測到26 種脂質氧化產物，分別屬于醛類、酮類、醇類和烴類化合物。肉中的脂質氧化可產生醛、醇、酮以及烴類等物質，其含量在適宜的范圍內可對羊肉的風味產生積極的影響；含量過高則說明肉中脂質過度氧化，會導致肉的劣變[16]。

由表2可知，檢測到的醛類物質主要包括己醛、庚醛、辛醛、壬醛以及苯甲醛等。己醛主要來源于亞油酸和花生四烯酸的氧化，是評定肉類脂氧化狀態的重要指標[17]。己醛和壬醛是主要的脂質氧化產物，而少部分的支鏈醛和芳香醛則由蛋白質降解或與糖類相互作用產生[18]。在飽和醛中，放牧飼養蘇尼特羊肉中的己醛、辛醛和壬醛的含量顯著低于舍飼飼養（P＜0.05）；不飽和醛中，舍飼飼養蘇尼特羊肉中(E)-2-辛烯醛和(E,E)-2,4-十二碳二烯的含量顯著高于放牧飼養（P＜0.001，P＜0.05）；在芳香醛中，放牧飼養蘇尼特羊肉中苯甲醛的含量顯著高于舍飼飼養（P＜0.05）。整體上，對脂質氧化程度影響比較大的醛類物質主要有己醛、庚醛、辛醛、壬醛，均在舍飼飼養羊肉中含量較高。

醇類物質也是脂質氧化的產物，其中1-戊醇和1-己醇由棕櫚酸和油酸產生，而1-辛烯-3-醇的前體物質為亞油酸和花生四烯酸，由LOX催化產生[19]。由表2可知，舍飼飼養蘇尼特羊肉中1-辛烯-3-醇的含量顯著高于放牧飼養（P＜0.05），但己醇和苯甲醇含量顯著低于放牧飼養（P＜0.01，P＜0.05）。兩種羊肉中含量比較高的醇類物質為1-辛烯-3-醇，是脂質氧化產物中醇類物質的主要組成部分。

表2 兩種飼養方式蘇尼特羊肉的脂質氧化產物Table 2 Lipid oxidation products identified in meat from Sunit sheep subjected to two feeding patterns

酮類化合物是脂肪氧化的另一種產物，本研究中共檢測出2 種酮類化合物。其中，舍飼飼養羊肉中2,3-辛二酮含量高度顯著高于放牧飼養（P＜0.001）。在脂類物質氧化過程中，烷氧基被另一個烷游離基氧化從而生成2,3-辛二酮，其是酮類中最主要的脂質氧化產物[20]。

烷烴類化合物主要由脂肪酸烷氧自由基均裂產生，在肉中占的比例較少[21]。蘇尼特羊肉中共檢測出2 種烴，分別為十三烷和十六烷。其中，放牧飼養羊肉中十三烷的含量顯著高于舍飼飼養（P＜0.05），而十六烷僅在放牧飼養羊肉中被檢測到。整體上，烷烴類物質含量較低，不是脂質氧化的主要產物。

綜上，脂質氧化的主要產物為己醛、庚醛、辛醛、1-辛烯-3-醇以及2,3-辛二酮。這些物質均在舍飼飼養羊肉中含量較高，進一步反映了舍飼飼養羊肉的脂質氧化程度比較嚴重。

2.2 兩種飼養方式蘇尼特羊肉抗氧化能力

表3 兩種飼養方式蘇尼特羊肉的抗氧化能力Table 3 Antioxidant properties in meat from Sunit sheep subjected to two feeding patterns

動物機體內存在著一套抗氧化機制，包括非酶與酶類物質，其可清除組織內的自由基，使機體呈現一種動態平衡[22]。由表3可知，放牧飼養羊肉中的T-AOC高度顯著高于舍飼飼養（P＜0.001），這說明放牧飼養羊肉的抗氧化能力較強。自由基可引發脂質氧化鏈式反應，而RSA則反映肌肉組織中所有抗氧化物質組成的抗氧系統對自由基的清除能力[23]。RSA在飼養方式上沒有顯著性差異（P＞0.05）。CUPRAC能反映肉中抗氧化物質的含量，放牧飼養羊肉中的CUPRAC顯著高于舍飼飼養（P＜0.05）。整體上，放牧飼養羊在抗氧化方面具有優勢，這可能與肉中含有豐富的抗氧化成分有關，這些抗氧化成分能減輕肉質的氧化損傷[24]。

2.3 兩種飼養方式蘇尼特羊肉中抗氧化酶活力

表4 兩種飼養方式蘇尼特羊肉的抗氧化酶活力Table 4 Antioxidant enzymes activities in meat from Sunit sheep subjected to two feeding patterns

肉中抗氧化酶系統通常以SOD、CAT和GPx為代表。SOD是第一個激活酶，它能清除超氧陰離子自由基產生H2O2和O2，隨后CAT和GPx清除H2O2，其活力能反映肉中抗氧化酶清除自由基的能力[25]。由表4可知，放牧飼養羊肉的SOD活力高度顯著高于舍飼飼養（P＜0.001）；CAT、GPx活力顯著高于舍飼飼養（P＜0.05）。CAT可繼續將由SOD催化產生的H2O2分解為H2O和O2；GPx可清除細胞液和線粒體中的脂質氧化產物、H2O2及自由基，避免組織產生氧化損傷[26]。整體上，放牧飼養羊抗氧化酶活力高于舍飼飼養，一方面，這可能是因為放牧飼養羊攝入了大量的抗氧化活性物質，對抗氧化酶活力有協同促進的作用；另一方面，放牧飼養羊活動范圍較廣，運動量較舍飼飼養羊大，這也提高了其肌肉中抗氧化酶的活力[27]。有研究表明，適量的運動可增強抗氧化酶活力，清除組織中的自由基[28]；而舍飼飼養羊活動范圍受限，運動量小，抵抗機體氧化的能力弱，從而導致其抗氧化酶活力較低。

2.4 兩種飼養方式蘇尼特羊肉的抗氧化酶相關基因表達量

表5 兩種飼養方式蘇尼特羊肉的抗氧化酶相關基因表達量Table 5 Antioxidant gene expression in meat from Sunit sheep subjected to two feeding patterns

組織內調控抗氧化酶的相關基因有SOD、CAT和GPx，這些基因的表達量可進一步反映抗氧化酶的活性[29]；而LOX基因能調控LOX活性，并反映肉中MDA含量。如表5所示，在兩種飼養條件下，4 種基因在蘇尼特羊肉中均有表達，放牧飼養羊肉中3 種抗氧化酶基因的表達量均高于舍飼飼養，其中SOD基因的表達量高度顯著高于舍飼飼養（P＜0.001）；CAT和GPx基因的表達量顯著高于舍飼飼養（P＜0.05）。抗氧化酶基因的表達量能反映抗氧化酶的活性，進一步從分子水平上驗證了放牧飼養羊的抗氧化能力較舍飼飼養好。Vahedi等的研究也證實了羊肉中的抗氧化酶基因（SOD、GPx）表達量的增加能提高抗氧化酶活性[29]。脂質的酶促氧化是在LOX的作用下進行的，并會產生一些揮發性物質，放牧飼養羊LOX基因表達量高度顯著低于舍飼飼養羊（P＜0.001），這說明舍飼飼養羊肉中調控LOX的基因非常活躍，從而加速了舍飼飼養羊肉的脂質氧化。

3 結 論

舍飼飼養蘇尼特羊肉TBA值高于舍飼飼養，并且羊肉中的脂質氧化產物含量較高，這表明舍飼飼養羊肉的脂質氧化程度比較嚴重。放牧飼養羊的T-AOC、CUPRAC和SOD、CAT、GPx活力均高于舍飼飼養羊，這說明放牧飼養羊肉的抗氧化能力較高，能有效抑制肉中的脂質氧化。進一步分析兩種飼養方式下羊肉中的抗氧化酶相關基因表達量，發現舍飼飼養羊肉中LOX基因表達量高于放牧飼養，而SOD、CAT和GPx基因表達量均低于放牧飼養，從分子水平驗證了舍飼飼養羊肉脂質氧化程度更嚴重，而放牧飼養羊肉的抗氧化能力較好。