AMPK 活性對宰后牛肉糖酵解、肌肉內環境及品質的影響

高永芳，宮玉霞，楊雅媛，韓 玲,*，余群力,*，朱躍明，韓廣星，薄文喜

（1.甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070；2.甘南藏族自治州畜牧工作站，甘肅 甘南 747000；3.張掖市萬禾草畜產業科技開發有限責任公司，甘肅 張掖 734000；4.國家肉牛牦牛產業技術體系臨沂站，山東 臨沂 276000；5.河北福成五豐食品股份有限公司，河北 廊坊 065201）

宰后肌肉轉化為肉需要經過一系列復雜的生理生化過程，其中能量代謝尤其是糖酵解是這些變化過程的重要途徑[1]，而糖酵解與肉色、pH值、嫩度及保水性等肉質性狀密切相關，因此，能夠調節宰后糖酵解進程并影響肌肉品質的單磷酸腺苷活化蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）無疑是一個有效的研究靶點。AMPK是能被AMP激活的蛋白激酶，由一個催化亞基α和兩個調節亞基β、γ共同構成，編碼每個亞基的基因不同，α亞基有α1和α2兩種異構體，分別被PRKAA1、PRKAA2基因編碼，其Thr（172）磷酸化是AMPK激活的必要條件[2]。屠宰后胴體血液循環及供氧中斷，肌肉進行無氧酵解產生能量，生成的ATP含量減少，同時肌肉中ATP消耗繼續導致AMP/ATP的比值增加，這種能量狀態激活AMPK[3]，活化后的AMPK通過抑制糖原合成代謝等途徑以減少ATP的消耗，同時促進糖酵解、葡萄糖轉運等途徑增加ATP的產生，從而調節機體能量供求平衡，是調控能量代謝的開關。

5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷（5-a m i n o-4-imidazolecarboxamide，AICAR）是可透過細胞膜的AMPK專一性激活劑，可磷酸化為5-氨基-4-咪唑甲酰胺核苷酸，5-氨基-4-咪唑甲酰胺核苷酸作為AMP模擬物激活AMPK的同時提高宰后糖酵解水平[4]。然而，在牛肉宰后成熟過程中，AICAR是否通過提高AMPKα基因mRNA轉錄量進而提高糖酵解水平，同時對宰后肌肉內環境及肉品質造成影響的研究，國內外鮮見報道。Young等[5]研究發現，AMPK激活劑AICAR能夠激活大鼠骨骼肌糖原磷酸化酶加速糖原分解；Park等[6]研究發現AICAR激活AMPK會使肌肉呈現更快速收縮，更具糖酵解性質；有研究指出AMPK活性變化與不同極限pH值牛肉的產生密切相關[7-10]。以上研究均表明AMPK活性受多種方式的調控，因此可通過調節AMPK活性，以降低動物的宰前應激反應，并進一步改善肉的品質，降低異質肉的發生率，這對牛肉品質的改善具有重要意義。

本實驗以0.50 mol/L AICAR處理的西雜牛背最長肌為對象，通過測定牛肉宰后成熟過程中AMPK活性、AMPKα基因mRNA及P-AMPK表達量、糖酵解水平、肌肉內環境和品質指標的變化，研究AICAR處理對宰后肌肉AMPK的激活作用及對糖酵解、肌肉內環境及肉品質的影響，為深入研究AMPK活性與宰后肌肉糖酵解、肌肉內環境及品質的關系，進而實現調控宰后肌肉品質提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選取甘肅省張掖地區（海拔1 400 m左右）同一牧場、生長發育正常、健康無病、公母各半、體質量相近（公牛（600±50）kg、母牛（450±60）kg）、年齡2～4 歲的西雜牛（西門塔爾公?！帘镜攸S牛）10 頭，宰前禁食16～18 h，禁水2 h，屠宰放血后立即取牛胴體中部背最長肌肉樣備用。

AICAR、RNAiso Plus、Prime ScriptTMRT reagent Kit with g DNA Eraser（Perfect Real Time）、SYBR Premix ExTaqTMII、pMD?19-TVector Kit 大連寶生物工程有限公司；牛磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（P-AMPK）ELISA試劑盒、己糖激酶、乳酸、糖原游離葡萄糖、能量因子含量測定試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

Avanti J-E型臺式冷凍離心機 美國Beckman Coulter公司；CFX96TM實時定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀、凝膠成像系統 美國Bio-Rad公司；PCR擴增儀 北京賽默飛科技有限公司；JSM-5600LV低真空掃描電子顯微鏡儀 英國牛津儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集和制備

以上述背最長肌為試材，去除表面脂肪及結締組織后，分割為每塊約250 g的肉樣，按照肉液比10∶1（m/V）將0.50 mol/L AICAR溶液均勻注射進肉塊中，以不作任何處理的肉樣為對照組，采用托盤包裝，隨后立即取約40 g肉樣分裝并投入液氮中作為0 h肉樣，剩余肉樣置于0～4 ℃下成熟。

在成熟時間點分別測定pH值、肉色及蒸煮損失等指標，對于肌原纖維小片化指數（myofibrillar fragmentation index，MFI）、AMPK活性等不便立即測定的指標，將肉樣用鋁箔紙包裹，置于－80 ℃凍藏待測。

刺殺放血后立即取背最長肌切成約100 mg的肉塊，立即放入滅酶滅菌凍存管中，置于液氮中速凍后于－80 ℃凍藏，用于AMPKα基因表達量及P-AMPK免疫沉淀的測定。

1.3.2 實時熒光定量PCR實驗

1.3.2.1 引物序列來源及合成

參照田萬強[11]的設計方法。以β-actin為內參基因，參照GenBank收錄的β-actin、PRKAA1、PRKAA2基因的mRNA序列，運用Primer 5.0軟件和Oligo軟件設計特異性引物，由上海生工生物技術有限公司合成（表1）。

表1 用于實時熒光定量PCR的引物序列及PCR參數Table 1 Primer sequences and parameters used for quantitative real-time PCR

1.3.2.2 總RNA的提取

依據RNAiso Plus的實驗指導使用說明書提取肌肉總RNA[12]。用超微量紫外-可見分光光度計測定總RNA的濃度和純度，用質量分數1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。將質量較高的RNA立即反轉錄成cDNA儲存于－20 ℃或直接于－80 ℃保存備用。

1.3.2.3 反轉錄及實時熒光定量PCR擴增

總RNA采用Prime ScriptTMRT reagent Kit with g DNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒提取。采用SYBR Premix ExTaqTMII，pMD?19-TVector Kit試劑盒進行PCR擴增，每個樣本分別用待檢測基因和內參基因引物擴增，每個反應做3 個重復[13]。其中95 ℃預變性2 min；94 ℃變性20 s，60 ℃退火20 s， 72 ℃延伸30 s，40 次循環。

1.3.2.4 相對基因表達量的計算

采用2－??Ct計算法對實時熒光定量PCR數據進行處理分析，計算方法如式（1）、（2）[14]所示。

1.3.3 蛋白免疫印跡

取肉樣100 mg，按1∶10（m/V）加入預冷的勻漿緩沖液，冰浴勻漿。將勻漿液倒入1.5 mL EP管中，靜置10 min。4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液，分裝后存于－80 ℃保存待測。將1 mg/mL牛血清白蛋白標準蛋白分別配制為0、10、20、40、60、80、100 μg/mL，加入5 mL Bradford工作液，混勻后靜置5 min，根據蛋白質量濃度確定上樣體積。電泳結束后，將凝膠上的蛋白條帶通過轉移電泳方式轉印至聚偏氟乙烯膜上（濕轉），然后分別用非標記一抗及辣根過氧化物酶標記的二抗對其進行孵育、檢測。顯色及成像：按體積比1∶1混合增強化學發光（enhanced chemiluminescence，ECL）試劑盒中兩種液體，將上述混合液均勻鋪在聚偏氟乙烯膜表面，室溫作用4 min。抖掉膜上液體，放入化學發光成像系統成像。

1.3.4 AMPK活性測定

參考Underwood等[15]的方法，取肉樣約0.6 g，放入預冷的離心管中，按照1∶5（m/V）加入冷凍勻漿液，在3 000 r/min冰浴勻漿。然后4 ℃、12 000 r/min冷凍離心5 min，取上清液測定。具體步驟參照試劑盒說明書。

1.3.5 糖酵解指標的測定

用蒸餾水沖洗肉樣表面血漬，并用濾紙吸干殘留水分后將pH計的探頭插入肉樣，使pH計電極與肌肉充分接觸，待讀數穩定后記錄，每個肉樣隨機選擇3 個不同的部位重復測定3 次，取平均值。

肌糖原、乳酸、游離葡萄糖含量采用相應試劑盒進行測定，取2.0 g肉樣，加入8 mL磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）勻漿后3 000 r/min離心20 min，收集上清液，之后進行加樣、加酶、溫育、洗滌、顯色、終止等步驟，具體操作和結果計算參照各試劑盒的說明書進行。

1.3.6 能量代謝指標的測定

樣品前處理方法如上述肌糖原測定步驟，參照ATP、ADP、AMP、IMP試劑盒說明書測定其含量，用雙縮脲法測定樣品的蛋白含量。

1.3.7 肉品質指標測定

1.3.7.1 肉色測定

使用TC-P2A全自動色差計，先將儀器預熱30 min后用校正板校準。在肉樣表面取3 個不同的點測定L*、a*和b*值，分別取其平均值。

1.3.7.2 蒸煮損失率測定

參考H o l m a n等[16]的方法。取體積不小于6 cm×3 cm×3 cm的肉樣，去除表面脂肪，稱質量（m1）后放入蒸煮袋中，置于80 ℃恒溫水浴鍋中加熱，當肉樣中心溫度升至70 ℃時取出冷卻至室溫后稱質量（m2），按公式（3）計算蒸煮損失率。

1.3.7.3 剪切力測定

將肉樣沿肌纖維方向取3 個直徑為1.27 cm肉柱，用C-LM4型嫩度儀垂直肌纖維方向剪切肉柱，并記錄剪切力。

1.3.7.4 MFI測定

參考Wang Linlin等[17]的方法。取4.0 g肉樣，加入40 mL MFI分離液（100 mmol/L KCl、20 mmol/L K3PO4、1 mmol/L乙二胺四乙酸、1 mmol/L CaCl2，pH 7.0），勻漿后4 500 r/min離心15 min，棄上清液，沉淀重復上述步驟，沉淀再用20 mL分離液溶解后用紗布過濾。將濾液的蛋白質量濃度稀釋至0.5 mg/mL，立即在540 nm波長處測定其吸光度，MFI即所得吸光度乘以200。

1.3.7.5 掃描電子顯微鏡觀察

將肉樣切成0.5 cm×0.5 cm×0.3 cm的肉塊，于體積分數2.5%戊二醛溶液中4 ℃固定3 d，然后用0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.3）清洗數次，然后用乙醇梯度脫水，抽真空干燥，噴金后于掃描電子顯微鏡觀察微觀結構，加速電壓為20 kV，放大倍數為300。

1.3.8 數據處理與分析

每組實驗重復3 次，采用Origin 9.0軟件繪圖，SPSS 19.0軟件對數據進行單因素方差分析；采用Duncan’s法進行顯著性分析和多重比較。

2 結果與分析

2.1 總RNA純度檢測

圖1 肉樣總RNA電泳結果Fig. 1 Electrophoresis of total RNA from meat samples

用超微量紫外-可見分光光度計檢測提取的總樣品RNA，OD260nm/OD280nm比值在1.8～2.0，經質量分數1%的瓊脂糖凝膠檢測，條帶清晰，無條帶彌散現象，表明提取的總RNA質量較好，可用于后期實驗。

2.2 PRKAA1、PRKAA2 mRNA表達量分析結果

圖2 PRKAA1、PRKAA2基因相對表達量Fig. 2 Relative expression levels of PRKAA1 and PRKAA2 genes

PRKAA1和PRKAA2是編碼蛋白基因，能在骨骼肌細胞中表達。如圖2所示，隨成熟時間的延長，兩組PRKAA1、PRKAA2相對表達量均呈先升后降的趨勢，AICAR組顯著高于對照組（P＜0.05），表明AICAR提高了PRKAA1、PRKAA2表達量。Thaler等[18]研究的AICAR處理小鼠白肌纖維能夠提高AMPKα2表達量（P＜0.05），而AMPKα2能夠磷酸化失活糖原合成酶，表明AMPK可調控肌細胞能量代謝，這與本實驗結果一致；楊燁等[19]研究發現PRKAA1與快速酵解型肌纖維（IIB）表達呈顯著負相關，肌肉中IIB占主導會加速糖酵解進程，導致pH值迅速下降，由此推測PRKAA1與宰后肌肉pH值也存在一定的相關性。

2.3 P-AMPK免疫印跡分析結果

圖3 宰后成熟過程中P-AMPK蛋白免疫結果Fig. 3 Western blot results of P-AMPK during postmortem aging

由圖3可知，兩組P-AMPK活性均呈先升后降的變化趨勢，AICAR上調牛肉宰后成熟過程中P-AMPK活性（P＜0.05），并在12 h檢測到最高AMPK活性。成熟0～12 h過程中，對照組、AICAR組P-AMPK活性分別提高了38.2%、56.9%，表明AICAR提高了肌肉AMPK活性。

2.4 AMPK活力分析結果

圖4 宰后成熟過程中AMPK活力的變化Fig. 4 Change in AMPK activity during postmortem aging

AMPK可調節細胞能量代謝平衡，其活性高低可評判宰后糖酵解的速度和程度[20]。由圖4可知，隨成熟時間的延長，兩組AMPK活力均呈先上升后下降的變化趨勢，對照組AMPK活力極顯著低于AICAR組（P＜0.01）。當成熟至12 h時，對照組和AICAR組AMPK活力分別為138.19、200.69 U/L，與對照組相比，AICAR組AMPK活力提高了45.23%。成熟至168 h時，對照組和AICAR組AMPK活力分別為48.38、70.23 U/L，與對照組相比，AICAR組AMPK活力提高了45.16%，表明隨成熟時間延長AICAR的激活作用逐漸下降。

2.5 肌肉糖酵解水平分析結果

pH值是評價肉質的重要指標，宰后肌肉pH值下降速度和程度影響肌肉蛋白特性進而對肉質具有重要影響[21]。袁倩等[22]研究表明AMPK活性與不同極限pH值牛肉的產生密切相關。由表2可知，隨成熟時間的延長，兩組pH值均呈先降后緩慢上升的趨勢，成熟至72 h，對照組及AICAR組pH值均下降至最低值5.58、5.45，與對照組相比，AICAR組pH值降低了0.13，pH值下降速度較對照組快，表明AICAR加快了糖酵解進程，縮短了宰后牛肉成熟時間，這與Warriss等[23]報道的AMPK活化可促進糖酵解，進而影響肌肉pH值一致，說明AMPK活性變化能調節肌肉pH值。

表2 宰后牛肉成熟過程中糖酵解指標變化Table 2 Changes in glycolysis indexes during postmortem aging

為進一步驗證AMPK對宰后糖酵解的影響，對肌糖原、游離葡萄糖和乳酸含量進行測定。由表2可知，隨成熟時間的延長，兩組肌糖原含量均呈下降趨勢，宰后24～72 h，AICAR組肌糖原含量顯著低于對照組，120～168 h，AICAR組肌糖原含量低于對照組，但差異不顯著，這與Kurth-Kraczek等[24]研究證實的激活AMPK可促進骨骼肌糖酵解、加速糖原分解基本一致；同時，宰后成熟期間兩組游離葡萄糖水平差異不顯著，乳酸含量均呈先升后降的變化趨勢，72 h時達到最大值，其中成熟24～168 h過程中AICAR組乳酸含量顯著高于對照組（P＜0.05）。

2.6 肌肉內環境能量指標分析結果

圖5 宰后成熟過程中能量代謝相關指標的變化Fig. 5 Changes in energy metabolism-related indexes during postmortem aging

宰后成熟期間，ATP消耗增多，而其生成量減少，肌肉缺少能量供應，開始失控瓦解，解僵開始[25]。當ATP耗盡時，ADP會進一步釋放能量，產生AMP。由圖5A可知，隨成熟時間的延長，對照組和AICAR組ATP含量呈先下降后緩慢上升的變化趨勢，在宰后72 h分別達到最小值0.62、1.27 μmol/g，AICAR組比對照組高0.65 μmol/g，成熟72～168 h過程中ATP含量緩慢上升，可能是因為成熟后期ATP含量減少，AMPK促進葡萄糖轉運再生成ATP，以維持能量平衡；由圖5B可知，對照組和AICAR組ADP含量隨成熟時間的延長呈下降趨勢，在宰后24 h分別達到最小值0.88、1.45 μmol/g，與對照組相比AICAR組增加了0.57 μmol/g；由圖5C可知，兩組AMP含量總體先升后降，且AICAR組AMP含量極顯著高于對照組（P＜0.01），表明AMPK活性升高對肌肉能量狀態有重要影響，這與賈青等[26]研究的成熟時間對牦牛肌細胞內能量因子變化的影響結果基本一致；IMP是ATP降解的中間產物，其含量增加有助于肉品風味的改善，由圖5D可知，兩組IMP含量呈先升后降趨勢，其中AICAR組IMP含量極顯著高于對照組，成熟后期IMP含量下降可能是因為此時酸性磷酸酶活化降解IMP，這與Shi Ce等[27]得到的鰱魚宰后IMP含量變化趨勢基本一致。

2.7 AICAR對西雜牛肉品質的影響

2.7.1 肉色的變化

圖6 宰后成熟過程中色度的變化Fig. 6 Changes in beef color during postmortem aging

肉色是評定牛肉品質的重要指標，與肌紅蛋白含量和水分有很大關系[28]。由圖6可知，隨成熟時間的延長，兩組L*值、a*值、b*值均呈先升后降的變化趨勢。由圖6A可知，兩組L*值均在72 h達到最大值，隨后逐漸下降，其中成熟24～72 h過程中，AICAR組L*值均顯著高于對照組；由圖6B可知，對照組和AICAR組a*值在24 h分別達到最大值22.69、20.28，AICAR組a*值除168 h外，均顯著低于對照組（P＜0.05），成熟后期a*值下降可能是因為肌肉中氧合肌紅蛋白（oxymyoglobin，OMb）含量逐漸降低所致，這與陳景宜等[29]指出的不同部位宰后牛肉成熟期間a*值變化趨勢基本一致；由圖6C可知，兩組b*值在120 h達到最大值之后顯著下降，其中12～24 h，AICAR組b*值均顯著高于對照組，這與王瑋等[30]研究的豬背最長肌b*值于72 h后呈下降趨勢的結果不完全一致，這可能與研究的樣本及宰后成熟時間的不同有關。

2.7.2 蒸煮損失率的變化

圖7 宰后成熟過程中蒸煮損失的變化Fig. 7 Changes in cooking loss during postmortem aging

保水性是影響牛肉品質的關鍵因素，較少的蒸煮損失能一定程度上表征牛肉良好的保水性。由圖7可知，兩組蒸煮損失率均呈先升后降的變化趨勢，宰后72 h達到最大值，這是因為此時肌肉pH值接近蛋白質的等電點，蛋白分子間斥力減少，肌肉內部空間變小，保水性降低[31]。24～120 h，AICAR組蒸煮損失率顯著高于對照組（P＜0.05）；168 h時，兩組蒸煮損失率無顯著性差異（P＞0.05）。

2.7.3 剪切力的變化

剪切力能夠反映宰后肌肉嫩度，其值越低表示肉的嫩度越好。由圖8可知，兩組剪切力均呈先升后降的變化趨勢，72 h后牛肉剪切力顯著降低，這可能是因為宰后肌肉達到最大僵直后，肌纖維被肌肉內源酶破壞，肌肉嫩度增大所致。

圖8 宰后成熟過程中剪切力的變化Fig. 8 Changes in shear force during postmortem aging

2.7.4 MFI的變化

圖9 宰后成熟過程中MFI的變化Fig. 9 Changes in MFI during postmortem aging

由圖9可知，隨成熟時間的延長，兩組MFI均呈逐漸上升的趨勢（P＜0.05），表明肌原纖維蛋白降解程度越來越高，肌原纖維結構破壞越嚴重，肉的嫩度越好。成熟至12 h時，對照組與AICAR組MFI分別為31.84、38.73，AICAR組MFI值提高了21.64%，成熟至72 h，對照組與AICAR組MFI分別為55.67、64.74，AICAR組MFI值提高了14.01%。除0 h外，AICAR組的MFI均極顯著高于對照組（P＜0.01），可見，AICAR能夠加速宰后肌肉成熟速度并提高肌肉嫩度。

2.7.5 肌肉微觀結構變化

圖10 宰后成熟過程中肌原纖維微觀結構的變化Fig. 10 Changes in microstructure of myofibrils during postmortem aging

從圖10可看出，宰后成熟期間兩組肌纖維結構均發生明顯變化。成熟至24 h，對照組肌纖維結構完整清晰、連接緊密、排列有序，隨成熟時間的延長，肌纖維結構被破壞，宰后120 h，肌纖維大面積溶解斷裂，出現大量肌原纖維小片；宰后12～120 h，AICAR組肌纖維結構破壞程度大于對照組，表明AICAR能夠通過提高AMPK活性，提高肌纖維結構的破壞程度，進而加快宰后肌肉成熟進程。

3 結 論

AICAR能夠提高宰后成熟過程中肌肉AMPK活性和AMPKα基因及P-AMPK表達量，顯著加快肌糖原降解、pH值下降和乳酸積累的速率（P＜0.05），加快宰后肌肉糖酵解進程，同時AICAR組L*值、b*值、MFI和蒸煮損失高于對照組，剪切力顯著低于對照組（P＜0.05），通過對AMPK活性的調控，得到AMPK調節肉質的可能機理是，AMPK活化后改變肌肉糖原含量、乳酸積累量、pH值、肌肉內環境及微觀結構，使糖酵解的程度和速度發生改變，影響宰后肌肉的成熟進程，牛肉較早進入僵直完成成熟；因此AMPK及其級聯效應是改善肉品品質的重要靶點，未來可通過調控AMPK活力以改善肉品品質。