兔皮膠原快速明膠化分子機制

馮 鑫，蘇現波，馬明思，馬 良，戴宏杰，余 永，郭 婷，周鴻媛，張宇昊,*

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.邯鄲學院生命科學與工程學院，河北 邯鄲 056005）

近年來，我國兔肉產業發展迅速，產量約占世界總產量的40%[1]。兔皮是兔肉加工副產物，也是制備明膠的優質資源。傳統的豬、牛源明膠具有良好的凝膠特性，但因疫病和宗教等原因使用受到很大限制；水產明膠在宗教和疫病方面不受限制，但因其亞基氨基酸含量偏低，導致凝膠特性較差，無法被廣泛應用。本課題組前期研究表明，兔皮明膠的凝膠特性、起泡性、乳化性、成膜性等功能特性均不遜于豬皮明膠[2-7]，且沒有疫病威脅，宗教限制程度也遠低于傳統的豬、牛源明膠。因此，具有良好的應用前景。

此外，兔皮用于制備明膠的最大優勢在于兔皮可經稀酸處理后快速實現明膠化。Yu Wei等[8]以兔皮為原料提取明膠，結果表明質量分數為1%的鹽酸處理10 min可制得較高得率和凝膠強度的兔皮明膠；Ma Mingsi等[9]對兔皮膠原快速明膠化的機理進行了初步研究，結果表明，在酸處理過程中，兔皮膠原纖維中的共價交聯可在短時間內被破壞，進一步延長酸處理時間則會造成膠原中亞基組分的降解，使后續清洗過程中損失率提高，進而降低明膠的得率和凝膠特性。此外，隨著酸處理的進行，兔皮膠原中氫鍵被破壞，并在酸處理1 h后形成新的平衡，此時明膠化已經完成。該研究初步明確了兔皮快速明膠化的機理，但在明膠化過程中兔皮膠原分子結構的變化規律方面并未得出明確結論。

分子模擬又稱“計算機模擬”或“計算機實驗”，是一種根據實際體系在計算機上進行的實驗，通過比較模擬結果與實際體系的實驗數據來檢驗模型的準確性，并可檢驗由模型導出的解析理論所作的簡化近似是否成功[10-12]。目前分子模擬技術已發展成為生物信息學、分子生物學、化學和實驗科學等領域中一種重要的研究工具[13-15]。通過分子模擬可建立多肽、蛋白質分子的初始模型，也可顯示已被測定的蛋白質分子的空間結構，幫助和促進蛋白質肽鏈折疊和蛋白質結構的預測、總結蛋白質的結構規律、揭示蛋白質結構與功能的關系[16-20]。最初分子模擬的應用主要集中在分子生物學以及化學領域，在食品研究領域的應用較少，其主要原因在于多數食品蛋白并不像β-乳球蛋白具備完全解析的結構模型[21-23]。但隨著蛋白質數據庫的不斷完善和同源建模預測技術的不斷發展，使得以已知蛋白質結構為模板，通過對比蛋白的一級序列來篩選和預測未知蛋白質高級結構成為可能[24-26]。目前在蛋白數據庫中，并無完全解析的膠原蛋白模型，但在數據庫中能夠檢索到兔皮膠原較為完整的氨基酸序列，為膠原蛋白模型的構建提供了依據。

因此，本研究在實驗室前期兔皮膠原快速明膠化的基礎上，依據檢索到的兔皮膠原一級序列，采用分子模擬技術構建相應的模型結構，依據實際實驗調整設置酸處理環境，模擬兔皮明膠化過程，以期全面解析兔皮膠原明膠化過程中膠原的結構變化，為實現兔皮明膠的科學、高效制備提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 模型構建

通過Uniprot（https://www.uniprot.org/）查找兔皮I型膠原α1鏈和α2鏈氨基酸序列，并以此作為建模的依據。

非螺旋區域：膠原蛋白的非螺旋區模板通過NCBI BLAST進行檢索，選擇E-value得分以及比對結構得分（total score）較優的蛋白結構作為模板結構。通過YASARA軟件對膠原蛋白三維結構進行同源建模。

三螺旋區域：三螺旋結構具有典型性，可采用CCBuilder Mk.2軟件直接進行模型構建。

1.2 模型評價

分別用PROCHECK和ERRAT程序對優化后模型蛋白結構進行評價。

1.3 單體系動力學模擬

以YASARA動力學軟件對膠原蛋白進行動力學模擬，使用AMBER14力場，體系壓力為1×106Pa、溶劑密度為0.997 g/L、pH值為1.02、模擬溫度為25 ℃。I型膠原蛋白的三螺旋結構通過CC Builder Mk.2軟件構建，非螺旋肽結構來自于同源建模結果。確定模擬體系的溫度耦合采用“Berendsen thermostat”法，壓力耦合采用“manometer”方法，參照壓力為3×107Pa。采用標準立方盒包裹模型及其他分子，復合物置于盒子中心，盒子設置成周期循環，并添加抗衡離子（Na＋和Cl－）固定蛋白，使用最陡下降法對溶劑進行能量優化，然后再用局部最陡下降法消除原子間的碰撞；隨后限制蛋白主鏈，使用最陡下降法對溶劑進行能量優化，然后再用局部最陡下降法消除原子間的碰撞；每100 ps保存一個軌跡。

上述方式進行模擬體系中的遠程范德華力作用距離取0.8 nm，經典相互作用使用球型截斷半徑“cut-off”方法計算。使用YASARA軟件包的動力學腳本（md_run.mcr）進行動力學模擬。

1.4 數據處理與分析

數據分析處理采用YASARA和Origin 8.0軟件。

2 結果與分析

2.1 模型構建

膠原蛋白具有三螺旋區域和兩端非螺旋區域，對2 個區域分別進行建模，結果如圖1所示。

圖1 膠原蛋白三維結構示意圖Fig. 1 Schematic three-dimensional structure of collagen

2.1.1 非螺旋區模型構建

通過NCBI BLAST對非螺旋區域模板進行檢索，發現膠原非螺旋區具有5K31、4AE2、4AEJ 3 個模板。以E-value得分以及比對結構得分（total score）為依據，對3 種模板進行篩選。選擇較優的蛋白結構作為模板結構，進行后續的計算。兔皮膠原α1、α2鏈的氨基酸序列和3 個模板的序列比對結果如圖2所示，模板相關信息見表1。

圖2 肽鏈α1、α2非螺旋部分殘基與模板5K31、4AE2、4AEJ 的序列比對Fig. 2 Sequence alignment of α1, α2 non-helical residues with 5K31,4AE2 and 4AEJ templates

表1 同源性模板序列比對結果Table 1 Results of homologous template sequence alignment

通過圖2的序列比對可知，兔皮膠原氨基酸序列與模板的覆蓋率為71%～74%，序列匹配一致性為63%～91%，具有較高的一致性。表1顯示的是3 種模板的得分情況，一般來說總體分值高于300或者E值小于1 e－5的晶體可以作為候選模板進行同源建模[27]。由表1可知，5K31、4AE2、4AEJ 3 個模板均滿足以上條件。為此，通過YASARA軟件對3 個模板進行混合建模以進一步篩選，在這一過程中只有模板5K31通過了模型迭代，因此確定5K31為最終模板。所構建的非螺旋區模型如圖3所示。

圖3 非螺旋區結構模型示意圖Fig. 3 Schematic representation of the non-helical region model

2.1.2 三螺旋區模型構建

膠原的三螺旋結構具有典型性，通過CC Builder Mk.2軟件可直接進行I型膠原蛋白三螺旋區域模型的構建，模型構建結果如圖4所示。

圖4 三螺旋結構模型示意圖Fig. 4 Schematic representation of the triple-helix model

由圖4可知，構建的三螺旋結構的α1與α2鏈均為左手螺旋（圖4A），3 個螺旋再形成右手超螺旋結構，并且3 條α肽鏈將相互交錯排列（圖4B），這些結構特征都與膠原蛋白結構相符合，說明通過此方法構建的三螺旋結構在空間構象上合理。

2.2 模型評價

采用PROCHECK和ERRAT程序對優化后模型蛋白的結構進行評價。拉氏圖（Ramachandran plot）主要用于指明蛋白質或肽中氨基酸殘基的允許和不允許的構象。拉氏圖主要分為3 個區域：允許區（紅色區域）、最大允許區（黃色區域）和不允許區（空白區域），圖中的黑點代表氨基酸二面角。三螺旋結構模型的拉氏圖顯示，模型中100%氨基酸二面角位于允許區（圖5）。而非螺旋肽結構模型99.2%的氨基酸二面角在合理的范圍之內，2 個模型均符合立體化學能量規則。

圖5 三螺旋結構模型和非螺旋肽結構模型的拉氏圖Fig. 5 Ramachandran plots of the triple-helix and non-helix models

2.3 單體系動力學模擬

實際明膠化過程是將膠原蛋白在質量分數為1% HCl溶液中進行5 min～24 h不等時間的酸處理。在分子模擬過程中，計算機處理時間與實際時間代表的含義不同，綜合考慮計算機的處理能力，在模擬過程中設定總處理時間為200 ns，旨在觀察二級結構的變化情況。

2.3.1 非螺旋肽結構的RMSD分析結果

均方根偏差（root mean square deviation，RMSD）可以近似顯示出體系構象的相對變化。單個、多個非螺旋肽結構的RMSD分別按式（1）、（2）計算。

式中：Rmsdi是第i個構象的RMSD，表示第i個構象與參照構象的平均偏差；Ne是構象數；σR是Ne個構象的Rmsdi漲落；Rd描述了Ne個構象的平衡程度。

由圖6可知，對同源建模得到的非螺旋肽進行了200 ns的動力學模擬分析。在質量分數為1% HCl條件下，單個非螺旋肽結構的RMSD波動較小，只達到5 ?左右，說明酸處理對單個非螺旋肽結構構象變化影響較小。為此，本研究又觀察了多個非螺旋肽結構的RMSD變化，相比之下，2 個非螺旋肽結構的RMSD波動較大，在100 ns時達到30 ?左右。在0～100 ns期間，2 個非螺旋肽結構的RMSD呈現上升趨勢；而在100 ns后，2 個非螺旋肽結構的RMSD呈下降趨勢。在180～200 ns期間，2 個非螺旋肽結構的RMSD漸穩定。

圖6 I型膠原蛋白非螺旋肽結構RMSD隨模擬時間的變化趨勢Fig. 6 Change in of RMSD of non-helical peptides over simulation time

通過2 種體系的RMSD對比分析，發現多個非螺旋肽結構的RMSD波動十分明顯，為進一步分析多個非螺旋肽結構在實驗條件下RMSD波動較大的原因，每50 ns提取動力學軌跡進行作圖分析，非螺旋肽結構隨模擬時間的變化結果如圖7所示。

圖7 非螺旋肽結構隨模擬時間的變化Fig. 7 Changes in non-helix structures over simulation time

隨著模擬時間推移，原本結合在一起的非螺旋肽部分逐漸分離。這是由于在強酸條件下，非螺旋肽能夠被質子化，在0～200 ns期間，非螺旋肽間的相互排斥作用使得非螺旋肽間彼此分離。0～100 ns期間非螺旋肽逐漸分散，相互排斥作用也導致非螺旋肽結構波動增加，RMSD升高。100 ns后多個非螺旋肽基本分離。由于非螺旋肽結構的緊密結合起著穩定膠原蛋白網絡穩定的重要作用，因此在強酸條件下，多個非螺旋肽結構的分離將導致膠原蛋白的三螺旋肽結構易于被酸破壞。

2.3.2 非螺旋肽的二級結構變化分析結果

為進一步探究非螺旋肽在質量分數為1%的HCl條件下二級結構的變化情況，對此條件下非螺旋肽二級結構相對含量變化情況進行分析，結果如圖8所示。

圖8 非螺旋區域二級結構含量隨模擬時間的變化趨勢Fig. 8 Changes in secondary structure contents in non-helical regions over simulation time

由圖8可知，在酸處理條件下，相對于單個非螺旋肽，多個非螺旋肽的無規卷曲結構相對含量有所增加，β-轉角結構相對含量有所下降。該結果說明，酸處理使得非螺旋肽的質子化，導致非螺旋肽間彼此相互排斥，原本緊密結合的β-轉角結構在正電荷相互排斥過程中，部分向無規卷曲結構發生轉換。

多個非螺旋肽的二級結構變化顯示，α-螺旋結構相對含量穩定在15%左右，β-折疊相對含量為30%左右，β-轉角和無規卷曲二者相對含量總和在50%～60%左右。從二級結構變化情況可以看出，多個非螺旋肽各個二級結構相對含量雖然有一定變化但是并不明顯，在酸處理條件下，該部分結構彼此分離后，空間結構并不會有太大改變，說明該部分不是引起實驗上二級結構數據變化的主要區域。

2.3.3 三螺旋結構的RMSD分析結果

為了觀察三螺旋結構在酸處理條件下的構象變化，對單個三螺旋結構進行了200 ns的動力學模擬分析，RMSD的分析結果如圖9所示。在0～30 ns期間，RMSD呈現上升趨勢，在30 ns時RMSD波動達到30 ?。在30～50 ns期間，RMSD逐漸穩定，在27～30 ?范圍內波動，系統評價50 ns后RMSD將一直處于平穩狀態，說明50 ns后易于明膠化部分的三螺旋結構已基本被破壞，剩余組分結構較為穩定，在短時間內不會發生變化，這與兔皮膠原明膠化過程中實際酸處理1 h內的情況類似，同時也說明相比于非螺旋區域，三螺旋區域的變化較為迅速，這可能是因為非螺旋區對三螺旋結構的穩定具有保護作用，伴隨著非螺旋肽的分開，原本結合在一起的膠原分子被分離，導致三螺旋結構充分暴露在酸環境中，其結構的穩定性更易被破壞。

圖9 單個三螺旋結構的RMSD隨模擬時間的變化趨勢Fig. 9 Changes in RMSD in single triple-helix structure over simulation time

2.3.4 三螺旋結構氫鍵含量分析結果

生物體系中最普遍、最基礎的物質蛋白質的結構和功能都與氫鍵密切相關[28-30]，在結構上蛋白質最重要的二級結構是由氫鍵決定的。為保證模擬過程更接近真實情況，對多個三螺旋結構的氫鍵變化情況進行分析，結果如圖10所示。

在0～50 ns，三螺旋結構的氫鍵數量從開始的225下降到175，說明此時被質子化的三螺旋結構由于正電荷排斥作用導致其結構穩定性降低，原始構象遭到了破壞；在50～200 ns期間，三螺旋結構的氫鍵數量基本保持在175左右，此時氫鍵數量處于相對平衡狀態，這可能是因為肽鏈間相互折疊卷曲不斷形成新的氫鍵。本課題組先前有研究表明：實際明膠化過程中酸處理5 min使膠原的原結構破壞，氫鍵數量降低，1 h后隨酸處理時間延長，氫鍵數量維持穩定[9]，故說明酸處理1 h與分子模擬50 ns的結果具有高度一致性，對于兔皮膠原來說，酸處理1 h以內為最有效明膠化時間。

圖10 三螺旋結構中氫鍵數量隨模擬時間的變化情況Fig. 10 Changes in the number of hydrogen bonds in a three-helix structure over simulation time

2.3.5 三螺旋區的二級結構變化分析結果

三螺旋結構是膠原蛋白特有的二級結構，在酸處理中，三螺旋結構逐漸被破壞，膠原肽鏈逐步轉化為其他二級結構。為進一步分析三螺旋區域二級結構的變化規律，對兔皮膠原最有效的明膠化時間即分子模擬50 ns（實際酸處理1 h）內，每10 ns提取動力學軌跡進行分析，分析結果如圖11所示。

圖11 三螺旋結構隨模擬時間的變化Fig. 11 Changes of three-helix structures over simulation time

未處理時，三螺旋結構完整有序；當加入酸處理條件時，膠原三螺旋空間結構立即被打破，肽鏈松散呈無序狀態，二級結構逐漸暴露。因軟件無法區分松散的三螺旋結構和無規卷曲結構，在此本研究列出了其他3 種二級結構相對含量的變化趨勢。隨著酸處理時間的延長，3 種有序二級結構的總含量整體呈現增加趨勢，說明三螺旋結構逐漸被破壞部分轉化為其他二級結構。在3 種結構中α-螺旋和β-折疊相對含量始終未超過10%，原因在于膠原三螺旋區域含有大量脯氨酸（Pro）和羥脯氨酸（Hyp），這2 種氨基酸無法參與α-螺旋和β-折疊形成，但α-螺旋和β-折疊相對含量之和在明膠化過程中隨著酸處理時間的延長而增加，到40 ns時達到最大值，而后開始下降，說明此時膠原中肽鏈中空間結構進一步展開，轉化為無規卷曲，同時氫鍵達到平衡，展開的肽鏈在酸的作用下可能開始降解，造成得率開始下降。本課題組前期研究過程中發現α-螺旋和β-折疊相對含量之和與明膠得率具有較強相關性[9]，與本研究結果一致，說明當α-螺旋和β-折疊相對含量之和達到最大時，明膠化程度最優。

綜上所述，酸誘導兔皮明膠化過程中，隨著酸處理開始，膠原非螺旋區亞基在酸的作用下開始分離，膠原三螺旋結構被破壞，轉化為其他二級結構，當膠原肽鏈中α-螺旋和β-折疊相對含量之和達到最大值時，膠原明膠化程度達到最優。

3 結 論

對兔皮明膠化過程進行分子模擬，通過模板選擇和YASARA同源建模構建出了兔皮膠原的非螺旋結構，采用CCBuilder Mk.2軟件構建出兔皮膠原的三螺旋結構。采用PROCHECK和ERRAT程序對優化后模型蛋白結構進行評價，2 個模型均符合立體化學能量規則。Verify-3D檢測結果表明，2 個模型質量良好。RMSD分析結果表明，隨著酸處理的進行，蛋白分子的非螺旋區亞基分離，但其中單個非螺旋區構象變化較小。三螺旋結構的氫鍵數量變化表明，酸處理導致三螺旋結構的氫鍵數量在短時間內迅速減少，模擬后期氫鍵數量保持相對穩定，處于平衡狀態，與實際酸處理1 h內的明膠化膠原紅外光譜的結果一致。三螺旋結構隨模擬時間的變化結果表明，隨著非螺旋區亞基結構的分離，膠原三螺旋結構被破壞，轉化為其他二級結構；α-螺旋和β-折疊相對含量之和呈現先上升后下降的趨勢，當α-螺旋和β-折疊相對含量之和達到最大時，明膠化程度最優。