黑果枸杞花色苷納米顆粒的制備及其對氧化低密度脂蛋白誘導的人臍靜脈融合細胞氧化損傷的保護作用

冉林武，米 佳，祿 璐，陳 菲，羅 青，李曉鶯，閆亞美,*，曹有龍，黃慶榮*

（1.寧夏醫科大學實驗動物中心，寧夏 銀川 750004；2.寧夏農林科學院枸杞工程技術研究所，寧夏 銀川 750002；3.羅格斯新澤西州立大學食品科學系，美國 新澤西 新布朗斯維克 08901-8520）

黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）為茄科枸杞屬多年生灌木，主要分布在我國寧夏、新疆、西藏、青海、內蒙古、甘肅等地區的鹽堿地、干旱地，屬于典型的荒漠植物。其早期作為一種藏藥收載于《本草晶珠》、《四部醫典》等藏醫藥著作中，用于治療心熱病、心臟病、月經不調、停經、高血壓、內分泌失調等病癥[1]?，F代研究表明，黑果枸杞果實富含鮮見的酰化矮牽牛素花色苷[2-4]，該類花色苷具有顯著的抗氧化等生物活性，可清除各種自由基[5]，有效地保護血管內皮細胞[6]、PC12神經細胞[7]的氧化損傷。同其他花色苷一樣，黑果枸杞花色苷穩定性易受到外界環境如氧化劑、親核試劑、酶、金屬離子、溫度以及光照等外界環境影響，因而限制了其在食品工業中的廣泛應用[8-9]。

微膠囊技術是一種用天然或合成高分子將固體、液體等物質包埋形成微小粒子的技術。它使被包埋物質與外界環境隔離，有效保護了其原有活性，增加其貯存穩定性。因食品來源帶電荷的多糖和蛋白質具有良好的生物降解性和無毒性，成為制備食品納米輸送載體的良好高分子材料[10-11]。其中，多糖類最常用的是殼聚糖（聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-P-D-葡萄糖（chitosan，CS））和海藻酸鈉。CS是甲殼素的脫乙酰衍生物，具有良好的親水性、生物相容性和生物可降解性，對人體安全、無毒副作用。CS帶有氨基，是唯一一種帶正電荷的多糖。因此，CS在水溶液中能夠通過靜電相互作用與帶負電的聚合物、大分子及一些多聚陰離子組裝形成納米膠囊，在包封生物活性分子的過程中發揮獨特的作用[12]。

酪蛋白磷酸肽（casein phosphopeptides，CPP）是以牛乳酪蛋白為原料，用胰酶或胰蛋白酶水解的具有生物活性的多肽。CS與CPP復合凝膠體系包埋多酚類物質，能夠有效地降低茶葉兒茶素等功效成分在胃腸道降解，增強其在小腸的吸收，從而提高其生物利用率[13]。此外，CPP與CS復合能夠有效降低CS納米顆粒的細胞毒性。Shoichet認為多肽修飾改性高分子聚合物能夠有效地消除高分子本身的細胞排異性，從而增強材料的生物相容性[14]。

花色苷通過納米微膠囊技術包埋，與游離花色苷溶液相比不會破壞其固有特性，且表現出更強的抗氧化損傷[15]、神經保護[16]、皮膚成纖維細胞暴露于長波長紫外線輻射下的潛在光保護能力[17]等生物活性，可能的機制在于納米包埋能夠提高其生物穩定性[18]。用于花色苷納米包埋的材料有金屬[16]和生物可降解大分子材料（CS[18]、聚乙二醇[19]、卵磷脂[20]、牛血清白蛋白[21]等）。本研究在上述研究的理論和技術基礎上，通過CS與CPP復合凝膠體系制備CS-CPP黑果枸杞花色苷納米顆粒，并優化其制備工藝，旨在通過微膠囊技術提高黑果枸杞花色苷的穩定性。同時，研究了CS-CPP黑果枸杞花色苷納米顆粒對體外氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL）誘導的人臍靜脈內皮EAhy926細胞氧化損傷的保護作用，為黑果枸杞花色苷的生物利用提供理論和技術依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

CS（分子質量100 kDa、脫乙酰率90%） 金殼生化試劑公司；CPP（含量99%） 湖北鑫源順醫藥化工有限公司；黑果枸杞 國家枸杞工程技術研究中心。

EAhy926細胞 上海細胞庫；胎牛血清 美國Gemini公司；高糖型DMEM培養基 美國Gibco公司；噻唑藍（thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT）試劑盒南京凱基生物公司。

1.2 儀器與設備

Amicon Ultra-15夾膜離心裝置、超純水制備系統美國Millipore公司；動態光散射儀 美國Brookhaven公司；Zetasizer Nano-ZlS90表面電位儀 美國Malvern公司；高速離心機 美國Beckman公司；NanoScope原子力顯微鏡 美國Veeco公司；全波長酶標儀、CO2培養箱、8025型pH計 美國Thermo Scientific公司；Axio Vert Al倒置生物顯微鏡 德國ZEISS公司。

1.3 方法

1.3.1 黑果枸杞花色苷的提取及質量濃度測定

黑果枸杞花色苷的提取及質量濃度測定依據閆亞美等[5]方法。采用質量分數0.5%三氟乙酸-甲醇溶液提取、旋轉蒸發儀濃縮制備黑果枸杞花色苷。采用pH示差法測定其質量濃度。

1.3.2 CS-CPP黑果枸杞花色苷納米顆粒的制備

采用離子凝膠化法[13]進行黑果枸杞花色苷納米顆粒制備。將不同質量濃度CS溶于體積分數1%醋酸溶液，超聲輔助溶解，直到溶液呈透明狀。用1 mol/L鹽酸或氫氧化鈉溶液調節CS和質量分數0.5% CPP溶液的pH值至4。室溫條件下攪拌，將2 mg/mL黑果枸杞花色苷溶液等體積添加到質量分數0.5% CPP溶液中。然后分別將1.0、0.8、0.6、0.5、0.4、0.2 mg/mL CS溶液等體積加入CPP-黑果枸杞花色苷溶液中，使其自發形成CS-CPP黑果枸杞花色苷納米顆粒。

1.3.3 CS-CPP黑果枸杞花色苷納米顆粒粒徑及分布的測定

動態光散射方法[20]測定CS-CPP黑果枸杞花色苷納米顆粒的粒徑及聚合分散系數。散射光角度固定在90°，測定溫度為（25±1）℃。儀器所用光源是固定激光，操作波長658 nm，功率30 mW。所有實驗均進行4 次。

1.3.4 CS-CPP黑果枸杞花色苷納米顆粒表面電勢的測定

應用Zetasizer Nano-ZlS90表面電位儀測定CS-CPP黑果枸杞花色苷納米顆?；旌衔锏谋砻骐妱輀13]。實驗在（25±1）℃下進行4 次。

1.3.5 CS-CPP黑果枸杞花色苷納米顆粒表面形態的觀察

應用原子力顯微鏡觀察納米顆粒的表面形態[13]。樣品溶液浸涂在新鮮清潔的云母片表面1 h，氮氣吹干。彈簧常數為40 N/m。室溫下觀察顆粒表面形態。

1.3.6 CS-CPP黑果枸杞花色苷納米顆粒中花色苷包封率和載藥量的測定

花色苷包封率根據Dupeyrón等[19]的方法測定。將CS-CPP黑果枸杞花色苷納米顆粒轉入Amicon Ultra-15夾膜離心過濾裝置中，離心，冷凍干燥被截留在過濾裝置中的納米顆粒。采用pH示差法測定濾液中花色苷的質量濃度。包封率、載藥量的計算分別如式（1）、（2）所示。

1.3.7 花色苷體外釋放曲線的測定

將1.3.2節獲得的CS-CPP黑果枸杞花色苷納米顆粒（CS最終質量濃度為0.25 mg/mL）用0.01 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）稀釋，定容到2 mL，置于37 ℃水浴鍋中。分別將孵育0、1、2、4、6、8 h的CS-CPP黑果枸杞花色苷納米顆粒加入到Amicon Ultra-15夾膜離心過濾裝置中，離心、收集濾液，檢測濾液中花色苷的質量濃度[13]。花色苷體外釋放率按式（3）計算。采用Higuchi方程計算納米顆粒體外釋放花色苷的釋放曲線。

1.3.8 MTT法檢測CS-CPP黑果枸杞花色苷納米顆粒對EAhy926細胞增殖的影響

將濃度為4×105個/mL的EAhy926細胞懸液接種于96 孔板，每孔加入100 μL，置于37 ℃、5% CO2培養箱內繼續培養12 h后更換培養液，加入花色苷質量濃度分別為0（對照）、100、200、300、400 μg/L的CS-CPP黑果枸杞花色苷納米顆粒，每個質量濃度梯度設5 個復孔。以只含培養基和CS-CPP黑果枸杞花色苷納米顆粒、無細胞孔為空白。培養箱內孵育24 h后每孔加入50 μL 1×MTT溶液（1 000 mg/L），37 ℃培養箱內孵育4 h，棄去孔內含有MTT的培養液，加入150 μL二甲基亞砜，室溫低速搖床振蕩10 min使結晶物充分溶解，在全波長酶標儀550 nm波長處測定細胞OD值[2]。細胞相對存活率按式（4）計算。

式中：ODs為樣品孔OD值；ODb為空白孔OD值；ODc為對照孔OD值。

1.3.9 CS-CPP黑果枸杞花色苷納米顆粒對ox-LDL誘導的EAhy926細胞氧化損傷的影響

將濃度為4×105個/mL的EAhy926細胞懸液接種于96 孔板，加入含花色苷質量濃度分別為0（對照）、50、100、150、200 μg/L的CS-CPP黑果枸杞花色苷納米顆粒，每個質量濃度設5 個復孔。培養12 h后，除對照組外，每孔加入終質量濃度為80 mg/L的ox-LDL。以只含培養基和CS-CPP黑果枸杞花色苷納米顆粒、無細胞孔為空白。37 ℃培養箱內孵育12 h后，每孔加入50 μL 1×MTT（1 000 mg/L），之后于37 ℃培養箱內孵育4 h，棄去孔內含有MTT的培養液，加入150 μL二甲基亞砜，室溫低速搖床振蕩10 min使結晶物充分溶解，用全波長酶標儀在550 nm波長處測定細胞OD值。細胞存活率按式（4）計算。

1.4 數據統計與分析

實驗所有數據進行4 次重復，并使用SAS軟件單因素方差分析進行統計分析，P＜0.05為差異顯著。使用Excel 2007軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 CS質量濃度對CS-CPP黑果枸杞花色苷納米顆粒粒徑及分布的影響

一般情況下，理想的納米微膠囊應具有較小的粒徑[22-23]。由圖1可見，CS質量濃度對CS-CPP黑果枸杞花色苷納米顆粒粒徑及分布影響較大。當CS質量濃度為0.10 mg/mL時，形成的顆粒粒徑為290 nm，聚合分散系數為0.32；當CS質量濃度增加到0.20～0.30 mg/mL時，顆粒粒徑下降到215～239 nm，聚合分散系數也下降到0.10～0.14，說明此時的CS-CPP黑果枸杞花色苷納米顆粒體系比較穩定；當CS質量濃度升高到0.40～0.50 mg/mL時，CS-CPP黑果枸杞花色苷納米顆粒粒徑呈增大趨勢，聚合分散系數也升高到0.26～0.37，說明該體系不穩定。賀博[24]制備的藍莓花色苷納米膠囊顆粒粒徑為214 nm，與本實驗所得較穩定的CS-CPP黑果枸杞花色苷納米顆粒粒徑差異較小。

圖1 CS質量濃度對CS-CPP黑果枸杞花色苷納米顆粒粒徑及分布的影響Fig. 1 Effect of CS concentration on particle size and polydispersity index of CS-CPP nanoparticles containing Lycium ruthenicum Murr. anthocyanins

2.2 CS質量濃度對CS-CPP黑果枸杞花色苷納米顆粒表面電勢的影響

圖2 CS質量濃度對CS-CPP黑果枸杞花色苷納米顆粒表面電勢的影響Fig. 2 Effect of CS concentration on zeta potential of CS-CPP nanoparticles containing Lycium ruthenicum Murr. anthocyanins

由圖2可見，隨著CS質量濃度的升高，形成的納米顆粒表面電勢開始增加，當CS質量濃度在0.20～0.30 mg/mL時，表面電勢從36 mV升至38 mV。納米顆粒表面電勢與分子的穩定性有關，溶液中納米微膠囊的表面電勢絕對值越大，其凝膠狀態相對越穩定，即溶解或分散可以抵抗聚集。相反，表面電勢絕對值越小，納米微膠囊越傾向于凝結或凝聚，即吸引力超過了排斥力，分散穩定性被破壞，易發生凝結或凝聚。當CS質量濃度大于0.20 mg/mL后，CS-CPP黑果枸杞花色苷納米微膠囊具有較大的表面電勢，表明其穩定性相對較好。該結果高于賀博[24]制得的羧甲基CS-CS鹽酸鹽納米膠囊。

2.3 CS質量濃度對CS-CPP黑果枸杞花色苷納米顆粒包封率和載藥量的影響

圖3 CS質量濃度對CS-CPP黑果枸杞花色苷納米顆粒包封率的影響Fig. 3 Effect of CS concentration on encapsulation efficiency of CS-CPP nanoparticles containing Lycium ruthenicum Murr. anthocyanins

由圖3可見，當CS質量濃度從0.10 mg/mL增加到0.25 mg/mL時，CS-CPP對黑果枸杞花色苷的包封率也不斷增加；CS質量濃度為0.25 mg/mL時包封率達到最高（70.2%）；當CS質量濃度增加到0.30～0.50 mg/mL時，包封率快速下降。

圖4 CS質量濃度對CS-CPP黑果枸杞花色苷納米顆粒載藥量的影響Fig. 4 Effect of CS concentration on loading rate of CS-CPP nanoparticles containing Lycium ruthenicum Murr. anthocyanins

由圖4可見，CS-CPP黑果枸杞花色苷納米顆粒的載藥量變化曲線與包封率相似。這可能是因為隨著CS質量濃度的升高，其形成更大的凝膠復合物結構，使得包封率和載藥量增加。但是，繼續增加CS質量濃度，不僅減小了用于包封黑果枸杞花色苷凝膠狀結構的空間體積，而且使溶液中納米顆粒團聚而形成絮狀沉淀，導致包封率和載藥量下降[25]。藥物包封率低是高分子藥物輸送系統中的一個缺點，在很大程度上限制了其應用。CS-CPP納米顆粒具有較高的黑果枸杞花色苷包封率，可作為其潛在的包封和輸送載體。

2.4 花色苷納米顆粒體外釋放分析

由圖5可見，當將制備的CS-CPP黑果枸杞花色苷納米顆粒在pH 7.0 PBS中37 ℃孵育時，隨著孵育時間的延長，花色苷的釋放率增加。在2 h時其釋放率為24.3%；4～8 h時釋放率在54.4%～64.2%之間，且增加速率減慢。胡冰[12]發現CS-CPP納米顆粒中表沒食子兒茶素沒食子酸酯體外釋放2 h時釋放率為20.5%，6 h時為32.4%。利用Higuchi方程對釋放曲線進行回歸分析，建立載藥納米顆粒的釋放動力學函數關系方程式：Q/%＝31.42t1/2－18.02（R2＝0.953），其中t1/2＝2.16 h。He Bo等[26]報道體外釋放2 h時CS納米顆粒中花色苷釋放率為47.73%，CS能顯著降低花色苷體外釋放率，利于花色苷活性的保存。納米顆粒釋放率的差異可能與納米顆粒與包封物交聯的結構有關[27]。

圖5 CS-CPP黑果枸杞花色苷納米顆粒體外釋放率Fig. 5 Release percentage of CS-CPP nanoparticles containing Lycium ruthenicum Murr. anthocyanins

2.5 CS-CPP黑果枸杞花色苷納米顆粒表面形態

圖6 CS-CPP黑果枸杞花色苷納米顆粒表面形態Fig. 6 Surface morphology of CS-CPP nanoparticles containing Lycium ruthenicum Murr. anthocyanins

應用原子力顯微鏡觀察CS-CPP黑果枸杞花色苷納米顆粒的表面形態。如圖6所示，形成的納米顆粒呈不規則球形，直徑為215.3 nm，表面電勢為36 mV，顆粒粒徑聚合分散系數為0.10。CS-CPP自組裝形成納米顆粒主要是由于CPP上帶負電荷的磷酸基團與CS上帶正電荷的—NH3＋基團之間的靜電相互作用[28]。Lan Yaqi等[29]報道CPP-CS納米粒子的典型粒徑為100～400 nm，而當發生復合凝聚時，其粒徑增加到900 nm。本實驗制備的CS-CPP黑果枸杞花色苷納米顆粒粒徑較小，且正的表面電荷能夠防止中和絡合物的聚集，導致納米顆粒分布均勻。

2.6 CS-CPP黑果枸杞花色苷納米顆粒對EAhy926細胞增殖的影響

圖7 CS-CPP黑果枸杞花色苷納米顆粒對EAhy926細胞增殖的影響Fig. 7 Effect of CS-CPP nanoparticles containing Lycium ruthenicum Murr. anthocyanins on the proliferation of EAhy926 cells

如圖7所示，當CS-CPP納米顆粒中黑果枸杞花色苷質量濃度為100 μg/L時，能顯著促進EAhy926細胞增殖；但當黑果枸杞花色苷質量濃度為400 μg/L時，能夠顯著降低EAhy926細胞存活率。花色苷是植物界中數量最多的水溶性色素，屬于黃酮類化合物家族。很多研究表明富含花色苷的水果具有保護心血管的作用[30-32]。本實驗中，低黑果枸杞花色苷質量濃度的CS-CPP納米顆粒具有促進EAhy926細胞增殖的作用，而高黑果枸杞花色苷質量濃度的CS-CPP納米顆粒呈現一定的毒性作用，其作用機制需要進一步研究。

2.7 CS-CPP黑果枸杞花色苷納米顆粒對ox-LDL誘導的

EAhy926細胞氧化損傷的影響

圖8 CS-CPP黑果枸杞花色苷納米顆粒對ox-LDL誘導的EAhy926細胞氧化損傷的影響Fig. 8 CS-CPP nanoparticles containing Lycium ruthenicum Murr.anthocyanins protected against ox-LDL-induced oxidative damage in EAhy926 cells

如圖8所示，ox-LDL誘導的氧化損傷EAhy926細胞存活率隨黑果枸杞花色苷質量濃度增大而升高，黑果枸杞花色苷質量濃度為100～200 μg/L時，EAhy926細胞存活率顯著升高。花色苷結構中有多個酚羥基，具有抗氧化、清除自由基、抑制細胞氧化損傷的作用[33-34]。林麗等[35]報道黑果枸杞花色苷具有保護血管內皮細胞免受氧化損傷的作用。本實驗中100～200 μg/mL黑果枸杞花色苷CS-CPP納米顆粒能夠保護血管內皮細胞免受ox-LDL誘導的氧化損傷。這可能與胡冰[12]報道的CS-CPP納米顆粒能夠提高活性成分的穩定性并促進更多活性成分進入細胞有關。

3 結 論

利用CS與CPP復合凝膠體系制備CS-CPP黑果枸杞花色苷納米顆粒最佳條件為：pH 4條件下，2 mg/mL黑果枸杞花色苷溶液與質量分數0.5% CPP溶液等體積混合，室溫攪拌，然后添加等體積0.20～0.30 mg/mL CS溶液。所得CS-CPP黑果枸杞花色苷納米顆粒粒徑為215.3 nm，表面電勢為36 mV，包封率為65.0%～72.2%。體外釋放實驗結果表明，CS-CPP黑果枸杞花色苷納米顆粒在pH 7.0時釋放率為24.3%～64.2%。體外細胞實驗結果表明，CS-CPP黑果枸杞花色苷納米顆粒在花色苷質量濃度為100～200 μg/L時能夠顯著提高ox-LDL誘導的氧化損傷EAhy926細胞存活率。