高壓靜電場預處理對花生芽活性物質及抗氧化能力的影響

張 茜，鄭雅瑩，李 妍，江正強，劉海杰,*

（1.北京食品營養與人類健康高精尖創新中心，中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083；2.北京農學院食品科學與工程學院，北京 102200）

花生（Arachis hypogaeaL.）又名落花生，屬雙子葉豆科作物，其不僅是中國重要的經濟作物，還是含優良高蛋白的油料作物[1]。花生籽粒含有豐富的營養物質，研究報道其營養價值能夠媲美肉、蛋及奶類食物，其與大豆一樣是農產品中優質的高價值油料作物[2]。花生籽粒不僅包含豐富的脂肪﹑蛋白質﹑維生素（VE）﹑礦物質等常見營養素，還含有如酚類（白藜蘆醇）、黃酮類及植物固醇（β-谷甾醇）等活性成分，其中白藜蘆醇被稱作“100 種熱門抗衰老物質”之一，花生也被營養學家評為A＋級作物[3]。

高壓靜電場（high-voltage electrostatic field，HVEF）技術是目前一種重要的種子處理方法。HVEF處理能夠對植物（如經濟作物、水果、蔬菜等）種子內部水分子、酶等物質產生刺激作用[4]，適宜的HVEF處理有利于種子體內ATP的合成和酶的活化，從而優化種子原有性質，促進其抗逆性，以達到種子發芽生長所需的良好條件。近些年的研究結果表明，靜電場處理對水稻、黃瓜和番茄等農作物的萌發生長均有顯著影響[5-6]。Huang Rukui等[7]用電場處理黃瓜種子進行發芽和膜通透性實驗，結果表明電場處理組黃瓜種子的發芽率得到顯著提高。

發芽目前被認為是應用廣泛的能夠提高種子營養成分生物利用率的成熟手段[8]。當休眠種子浸泡吸水之后，各種生理代謝隨水合作用的進行不斷增強[9]，種子發芽過程中貯藏物質降解，小分子活性物質合成或含量增加，抗營養因子（如單寧等）減少，通常表現為含水量升高、呼吸作用增強、根芽生長迅速、干物質不斷消耗等[10]。這種由豆類、蔬菜等種子或其他營養貯藏器官萌發生長的嫩芽及芽苗即為芽苗類蔬菜，因其具有生產工藝簡便、口感獨特及營養豐富等特點深受消費者青睞[11]。Lin Bosi等[12]對萌芽花生的毒理學進行評價，大鼠喂養萌芽花生18 周后，基本上未在其體內檢測到有害物質，且發現大鼠攝取適量花生芽后血清中甘油三酯含量減少。花生芽菜是近年出現的一種新型芽菜品種，目前對于花生發芽及其活性成分變化等方面缺少系統的研究。本實驗以花生籽粒為原料，研究了HVEF對于花生發芽過程中活性成分及抗氧化活性的影響規律，旨在尋找提高花生芽活性物質含量、增強其抗氧化能力的適宜的HVEF預處理條件，為花生芽產品的深度開發和利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生籽粒（‘小白沙’，手工剝殼）購自山東省花生研究所。

白藜蘆醇、福林-酚試劑、蘆丁、水溶性V E（Trolox）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 美國Sigma公司；2,4,6-三吡啶基三嗪 南京都萊生物技術有限公司；2,2’-聯氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt，ABTS） 日本東京化成工業株式會社。

1.2 儀器與設備

100H恒溫恒濕培養箱 科發豆芽機械設備有限公司；HVEF裝置由中國農業大學中日食品研究中心實驗室自行研制；UV-1600紫外-可見分光光度計 日本島津公司；6460液相色譜-質譜聯用儀 美國安捷倫公司；LGJ-18真空冷凍干燥機 北京四環科學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 HVEF預處理

HVEF裝置示意圖如圖1所示。

圖1 HVEF實驗裝置示意圖Fig. 1 Schematic diagram of the high-voltage electrostatic field

為研究不同電場強度HVEF對花生芽活性成分及抗氧化能力的影響，分別控制電場強度為250、300、400、450 kV/m，處理30 min后備用。以未經HVEF處理組作為對照。不同電場強度通過控制HVEF的電壓和極板間距調節。

1.3.2 花生芽生產

挑選飽滿、整齊一致的210 粒花生籽粒，單層平鋪在金屬板上進行HVEF處理，用28 ℃、4 倍籽粒體積的自來水浸泡6 h；蒸餾水沖洗3 次，瀝干水分；將其整齊均勻地鋪在濕潤紗布上，于26 ℃催芽24 h。將花生芽尖倒置插入珍珠巖中，每箱均勻播種60 粒左右；放入溫度28 ℃、相對濕度80%恒溫恒濕培養箱中黑暗培養，對照組（CK）花生芽生產方法同上，不使用HVEF處理。發芽1、3、5、7 d后分別采收，鮮樣用于測定胚軸長度，用于其他指標測定的花生芽樣品作冷凍干燥處理，粉碎過40 目篩，得到花生芽粉末。

1.3.3 花生芽胚軸長度的測定

花生發芽過程中用尺子測量花生芽的胚軸長度，每個處理組30 根花生芽。

1.3.4 花生芽總酚含量的測定

樣品醇提物制備：精確稱取花生芽粉末0.2 g于50 mL離心管中，加入10 mL體積分數80%乙醇溶液，于超聲波清洗器中60 ℃提取30 min，6 000 r/min離心10 min，取上清液備用。

總酚含量測定[13]：根據福林-酚比色法稍作修改，取500 μL上清液，加入福林-酚顯色劑1 mL，混勻，然后加入質量分數7.5%碳酸鈉溶液1 mL，用蒸餾水定容至10 mL，混合均勻，在室溫、避光條件下放置2 h，用紫外-可見分光光度計測定765 nm波長處的吸光度。以試劑空白為參比。以沒食子酸為標準品繪制標準曲線，總酚含量以沒食子酸質量計。

1.3.5 花生芽總黃酮含量的測定

總黃酮含量測定[14]：根據硝酸鋁-亞硝酸鈉光度法測定并稍作修改。取500 μL 1.3.4節得到的上清液，加入質量分數5%亞硝酸鈉溶液0.5 mL，混勻，靜置6 min；加入質量分數10%硝酸鋁溶液0.5 mL，混勻，靜置6 min。再加入1 mol/L氫氧化鈉溶液4 mL，用乙醇定容至10 mL，放置15 min，于510 nm波長處測定吸光度。以試劑空白為參比。以蘆丁為標準品繪制標準曲線，總黃酮含量以蘆丁質量計。

1.3.6 花生芽白藜蘆醇含量的測定

樣品的提取[15]：精確稱取花生芽粉末1 g于50 mL離心管中，加入10 mL體積分數80%乙醇溶液，于超聲波清洗器中60 ℃提取30 min，6 000 r/min離心10 min，取上清液，重復提取2 次，合并上清液并定容至25 mL，過0.45 μm微孔濾膜，得到預處理樣品。

高效液相色譜-質譜測定條件：Poroshell 120 EC-C18色譜柱（100 mm×3.0 mm，2.7 μm）；流動相：體積分數0.1%甲酸-乙腈（60∶40，V/V）；柱溫：30 ℃；流速：0.3 mL/min；進樣量為3 μL。對樣品進行分離后，再經質譜檢測，質譜條件為：正離子掃描，選擇離子[M＋H]＋m/z 229檢測。

1.3.7 花生芽抗氧化活性的測定

1.3.7.1 亞鐵還原能力的測定

亞鐵還原能力（ferric reducing antioxidant power，FRAP）工作液的制備：取0.3 mol/L醋酸鈉緩沖液（pH 3.6）50 mL，加入20 mmol/L FeCl3溶液5 mL混勻，再加入5 mL 2,4,6-三吡啶基三嗪溶液（10 mmol/L）混勻，于37 ℃水浴鍋中預熱備用。

取100 μL 1.3.4節得到的上清液，加入300 μL蒸餾水，加入預熱至37 ℃的FRAP工作液3 mL（現用現配），混勻后于暗處反應0.5 h，于593 nm波長處測其吸光度，以蒸餾水作為空白對照[16]。以Trolox作標準曲線，FRAP以每克花生芽相當于Trolox物質的量表示。

1.3.7.2 DPPH自由基清除能力的測定

離心管中加入200 μL 1.3.4節得到的上清液及1.0×10－4mol/L DPPH-乙醇溶液4.8 mL，混勻后于暗處反應0.5 h，于517 nm波長處測定吸光度Ai；加入200 μL花生芽提取稀釋液和4.8 mL乙醇，測定吸光度Aj；加入200 μL乙醇和4.8 mL 1.0×10－4mol/L DPPH-乙醇溶液，測定吸光度A0

[17]。DPPH自由基清除率按式（1）計算。以Trolox作標準曲線，DPPH自由基清除能力以每克花生芽相當于Trolox物質的量來表示。

1.3.7.3 ABTS陽離子自由基清除能力的測定

ABTS混合液制備：2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液與7 mmol/L ABTS溶液混勻，在室溫暗處放置12 h，即得ABTS工作液。將工作液與乙醇按照體積比約1∶45混合，于734 nm波長處調節其吸光度至0.700，即得ABTS混合液，于30 ℃水浴鍋中預熱備用。

取200 μL 1.3.4節得到的上清液，加入9.8 mL ABTS混合液（現用現配），在室溫下于暗處反應0.5 h，于734 nm波長處測其吸光度，以乙醇作為空白對照[18]。以Trolox作標準曲線，ABTS陽離子自由基清除能力以每克花生芽相當于Trolox物質的量表示。

1.3.8 花生籽粒電解質外滲率的測定

活花生籽粒外液電導率的測定[6]：供試的花生籽粒經HVEF處理后，各組取20 粒，用蒸餾水洗凈，再用濾紙吸干水分。將花生籽粒置于250 mL燒杯中，加入100 mL蒸餾水，24 h后搖晃燒杯，使溶液混勻并過濾，測電導率a。

死花生籽粒外液電導率的測定：各組取籽粒20 粒，用蒸餾水洗凈，再用濾紙吸干水分。將花生籽粒置于250 mL燒杯中，加入100 mL蒸餾水，煮沸20 min，冷卻后加蒸餾水至原刻度，以補充蒸發掉的水分，搖晃燒杯使溶液混勻并過濾，測電導率b。電解質外滲率按式（2）計算。

1.4 數據統計與分析

實驗獨立重復3 次，結果以平均值±標準差表示。采用SPSS軟件分析數據顯著性（Duncan’s檢驗），P＜0.05表示差異顯著。使用Origin軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 HVEF預處理對花生芽胚軸長度及外觀形態的影響

由表1可以看出，花生芽在生長過程中，隨著發芽時間的延長胚軸長度逐漸增加；前3 d胚軸生長較為緩慢，從第3天起生長迅速，胚軸長度呈明顯增長趨勢。不同電場強度對花生芽的生長影響不同，發芽至第7天時，電場強度為250、300 kV/m的處理組胚軸長度略高于對照組，但差異不顯著；400 kV/m HVEF處理對花生芽生長的促進作用最大，第7天時胚軸長10.19 cm，顯著高于對照組（9.14 cm），提升11.49%。當電場強度達到450 kV/m時，胚軸長度較對照組有所下降，原因可能是HVEF處理具有臨界效應，當電場強度超過其閾值范圍則會對生長產生不利影響[19]。

表1 花生發芽過程中胚軸長度的變化Table 1 Changes in hypocotyl length of peanut sprouts during germination

圖2 發芽7 d的花生芽形態Fig. 2 Morphology of peanut sprouts after germination for 7 days

不同電場強度HVEF預處理花生籽粒發芽7 d后花生芽表觀形態如圖2所示，結合表1結果可知，在本實驗條件下400 kV/m HVEF處理最適宜花生芽生長。

2.2 HVEF預處理后花生芽總酚含量的變化規律

經測定，‘小白沙’花生籽粒總酚含量為（149.70±4.59）mg/100 g（圖中未顯示）。結合圖3可知，花生經發芽后，總酚含量呈現不斷增加趨勢，在第7天時達到最大值。徐世杰等[20]對花生發芽期間總酚及黃酮含量變化進行研究，結果發現在發芽過程中總酚含量呈逐漸上升趨勢，未發芽籽粒中總酚含量僅為1.53 mg/g，而經過發芽5 d后其總酚含量可達2.73 mg/g，約為原籽粒的1.8 倍。該結果與本研究結果一致，進一步說明發芽可以提高花生中總酚含量。目前學者認為種子中植物多酚含量經發芽后顯著提高的原因可能是木質素會與酚酸交聯參與細胞壁構成，因此種子發芽及生長過程中會產生更多的酚酸，從而支撐細胞壁的形成[21]。

圖3 花生發芽過程中總酚含量的變化Fig. 3 Changes in total phenol conten in peanut sprouts during germination

花生芽生長過程中，HVEF預處理組總酚含量普遍高于對照組，其中400 kV/m處理組總酚含量較高，第7天可達297.67 mg/100 g，較對照組提升了22.09%。根據文獻[22]推測，HVEF處理花生籽粒后會引起機體組織細胞的氧化傷害，因此植物體需通過自身應激機制產生更多的抗氧化物質（如酚類）以抵御環境中活性氧對機體的損傷，因而適宜電場強度的HVEF預處理能夠促進植物體酚類物質的積累。

2.3 HVEF預處理后花生芽總黃酮含量的變化

圖4 花生發芽過程中總黃酮含量的變化Fig. 4 Changes in total flavonoid content in peanut sprouts during germination

經測定，‘小白沙’花生籽粒總黃酮含量為（326.00±8.40）mg/100 g（圖中未顯示）。結合圖4可知，花生芽總黃酮含量隨著發芽時間的延長呈現先升高后降低的趨勢，并且在第5天時達到最大值。有學者研究發現花生籽粒發芽4 d后黃酮含量明顯上升，約為未發芽籽粒的2 倍[20]，與本研究結果一致，說明花生經過發芽能明顯提高其總黃酮含量。

花生發芽過程中，HVEF處理組總黃酮含量普遍高于對照組。花生芽生長第5天時，300 kV/m處理后總黃酮含量最高，達到707.48 mg/100 g，較對照組增加了19.91%。說明電場輔助發芽能夠提高花生芽中總黃酮含量，推測其原因可能是植物體在受到外界環境刺激后容易產生更多的多酚和黃酮等抗氧化劑，以清除過多的活性氧物質，這些抗氧化劑既能夠直接還原活性氧，又能作為酶的底物發揮作用[22]。

2.4 HVEF預處理后花生芽白藜蘆醇含量的變化

圖5 培育7 d后花生芽的白藜蘆醇含量Fig. 5 Resveratrol content in peanut sprouts after germination for 7 days

經測定，‘小白沙’花生籽粒中未檢測到白藜蘆醇，發芽7 d后其白藜蘆醇含量增加至（3.82±0.06）μg/g，說明花生經過發芽，一定程度上提高了白藜蘆醇含量，這與Yu Miao等[23]的研究結果一致。此外，由圖5可以看出，隨著電場強度的不斷增加，花生芽中白藜蘆醇含量呈現先增加后降低的趨勢。與對照組相比，400、450 kV/m處理組的花生芽中白藜蘆醇含量顯著高于對照組，相比對照組分別提升了32.46%和20.94%；電場強度為400 kV/m的HVEF處理對花生芽中白藜蘆醇含量的提升作用最明顯。Tang Ke等[24]研究了紫外輻射對花生幼苗中白藜蘆醇含量及抗氧化酶活性的影響，發現植物會產生一種機制來降低和修復脅迫損傷，脅迫產生的自由基會激活抗氧化防御系統。白藜蘆醇為一種植物抗毒素，受到紫外輻射后，內源性白藜蘆醇以及芪合成酶含量迅速增加，植物中丙二醛含量及芽苗葉片表觀形態的變化呈現相似性。丙二醛含量是植物細胞膜過氧化程度的體現，植物體內丙二醛含量越高說明植株細胞膜受到的損傷越嚴重。Tang Ke等[24]測定了紫外輻射實驗組過氧化氫、超氧陰離子自由基清除率及抗氧化酶活性的變化，發現其變化趨勢與白藜蘆醇處理組顯示出相似性。因此，推測HVEF預處理后花生發芽可能對植物造成氧化脅迫，故需通過自身應激機制產生更多的植物抗氧化物質以抵御環境中活性氧對機體的損傷，從而導致花生芽中白藜蘆醇的積累。

2.5 HVEF預處理對花生芽抗氧化活性的影響

表2 培育7 d后花生芽的抗氧化能力Table 2 Antioxidant activity of peanut sprouts after germination for 7 days

實驗結果表明，隨著發芽時間的延長，花生芽抗氧化能力不斷增加（未在表中顯示），于第7天達到最高值，可見花生經過萌發生長可明顯增強花生芽的抗氧化活性。如表2所示，生長至第7天時，250、300、400 kV/m處理組花生芽FRAP顯著高于對照組，分別為304.65、335.08、343.70 μmol/L，分別較對照組提升11.61%、22.76%和25.93%；300、400、450 kV/m處理組花生芽的DPPH自由基清除能力顯著高于對照組，分別較對照組提升了30.37%、29.90%和11.85%，其中300 kV/m處理組效果較佳；300 kV/m處理組ABTS陽離子自由基清除能力（804.72 μmol/L）顯著高于對照組，相比對照組提升了11.53%。

Kang等[25]對萌芽花生乙醇提取物DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除能力進行測定，發現萌芽9 d后的花生芽具有較高的抗氧化活性，并且其子葉強于根莖。Limmongkon等[26]對西班牙5 種不同品種花生芽總酚含量及其抗氧化活性進行測定，發現對于不同花生品種，總酚含量及抗氧化活性隨發芽時間的延長變化規律有所差別，對于‘Tainan9’花生，其總酚含量及抗氧化活性（DPPH自由基清除能力和FRAP）隨發芽時間的延長而增強，說明花生經發芽后可顯著提高總酚含量及其抗氧化活性。參考文獻[27-28]，推測發芽期間抗氧化活性主要源于芽培期間花生中還原性物質的產生，如黃酮類、多酚類以及含巰基和酚羥基的氨基酸等物質。

2.6 HVEF預處理對花生籽粒電解質外滲率的影響

電解質外滲率是考察籽粒種皮細胞膜完整程度的重要指標之一，籽粒的活力與其電解質外滲率呈負相關。植物組織處于逆境損傷時，因其細胞膜結構遭到破壞或功能受損，使其透性增大，細胞內電解質會有一定程度的滲出，其浸泡液的電導率也會升高。因此，組織外滲液電導率的改變能夠在一定程度上反映細胞膜完整程度。如圖6所示，HVEF處理組花生籽粒的電解質外滲率比對照組降低了13.34%～15.59%，表明經HVEF處理后的花生籽粒細胞膜完整性較好，具有較高的生理活性。Wang Guixue等[6]研究了HVEF對老化水稻籽粒活性的影響，發現不同電場強度處理組相較對照組水稻籽粒電解質外滲率均有不同程度下降，說明HVEF處理能夠維持籽粒細胞膜的完整性。

圖6 HVEF處理對花生籽粒電解質外滲率的影響Fig. 6 Effect of HVEF treatment on leakage percentage of electrolytes from peanut seeds

3 結 論

本研究發現，花生籽粒經適宜電場強度的HVEF預處理后發芽，其體內活性成分及抗氧化活性有所提升，花生芽總酚、總黃酮、白藜蘆醇含量相比對照組均顯著增加，其中300、400 kV/m的HVEF處理對花生芽體內抗氧化成分含量的提升較顯著，300 kV/m處理組發芽第5天時總黃酮含量較對照組提升了19.91%；400 kV/m處理組發芽第7天時總酚和白藜蘆醇含量較對照組分別提升了22.09%和32.46%。經HVEF處理花生芽的FRAP及對DPPH自由基、ABTS陽離子自由基的清除能力均有不同程度提升，300、400 kV/m處理組花生芽提取物的抗氧化能力較強。由此可見，經適宜外源電場誘導能夠提高花生芽的營養價值和保健功能，對功能性花生產品的開發具有一定意義。