甜菜紅素對小鼠體內抗氧化及免疫調節的作用

包曉瑋，韓海霞，杜光明，魏辰業，朱 璇，任 薇，曾蘭君，張亞濤

（1.新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆農業大學化學工程學院，新疆 烏魯木齊 830052）

紅甜菜（Beta vulgarisvar. rubra）屬黎科（Chenopodiaceae）甜菜屬（Beta），是栽培甜菜的一個變種，又稱紫菜頭，俗稱牛皮菜，可生食、熟食或制成菜肴[1]。紅甜菜是歐洲和美洲國家的重要蔬菜之一，可以提取甜菜紅素，在馬來西亞、中國、日本、以色列和越南廣泛種植[2]。Ashwini等提出食品中的甜菜紅素既具有審美價值，又對健康有積極的影響[3]。甜菜紅素是一種甜菜苷紅色素，廣泛存在于莧科、藜科、紫茉莉科、商陸科等多種植物中，甜菜紅素屬于酮、醌類衍生物色素，是水溶性的天然食用紅色素，食用后不被代謝，無毒副作用，美國食品與藥物管理局對甜菜紅素作為食用色素的添加用量不作上限規定。Vidal[4]和Sawicki[5]等證實甜菜紅素具有抗炎、抗氧化能力和抗腫瘤活性。有研究報道，甜菜紅素可通過作用在線粒體途徑緩解百草枯對實驗大鼠造成的肝損傷和肺損傷間質性肺炎[6-7]。Farabegoli等通過研究發現甜菜紅素對Caco-2腫瘤細胞具有細胞毒性作用，提出可以利用甜菜紅素作為膳食成分，以減少和限制癌癥的發生和發展[8]。郝秀梅等[9]研究了紅甜菜水提物及其色素的體外抗氧化能力，結果表明，紅甜菜水提物及其色素有較強的抗氧化能力，且純化后的紅甜菜色素體外抗氧化能力更突出。王曉宇等[10]研究表明，甜菜紅苷能夠引起人結腸癌HT29細胞的凋亡，可能具有抗結腸癌和其他惡性腫瘤的效果。本研究利用DEAE-52纖維素提取、分離甜菜紅素，同時利用納濾和噴霧干燥技術制備甜菜紅素，進行甜菜紅素體內抗氧化及免疫調節作用研究，以期為今后開發紅甜菜作為功能保健食品提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、動物與試劑

紅甜菜來源于新疆農業大學三坪農場農學院。

清潔級KM小鼠（雄性）、豚鼠均購于新疆醫科大學實驗動物中心（生產許可證號：SCXK（新）2016003）；K592細胞 中國武漢典型培養物保藏中心；綿羊紅細胞、印度墨汁 廣東洛孚生物科技有限公司。

谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所；噻唑藍（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyl-2H-tetrazoliubromide，MTT）、刀豆素A（concanamycin A，ConA） 美國Sigma公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Dionex UltiMate 3000超高效液相色譜-高分辨率串聯質譜（ultra performance liquid chromatography-high resolution mass/mass spectrometry，UPLC-HRMS/MS）系統 美國Thermo Fisher公司；TU-1810紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；電子天平梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；LZ-0.5榨汁破碎一體機 靖江食品機械有限公司；納濾機 廈門世達膜科技有限公司；OPD-8噴霧干燥儀 上海大川原儀器有限公司；酶標儀 美國Bio-Rad公司；Shellab型醫用二氧化碳培養箱 美國希爾頓公司；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司；AE-31數碼倒置顯微鏡 麥克奧迪實業集團中國有限公司。

1.3 方法

1.3.1 甜菜紅素的制備

紅甜菜粉碎→紗布過濾→取汁→DEAE-52纖維素吸附紅甜菜汁→填裝進分離柱→體積分數1%鹽酸溶液洗滌→分離甜菜紅素→收集甜菜紅素

利用納濾膜進行過濾濃縮，濃縮后的甜菜紅素的色價為1 150.5 mL－1。將濃縮汁利用噴霧干燥技術制備成干粉備用，干物質得率為83%。

1.3.2 甜菜紅素UPLC-HRMS/MS分析

樣品處理：將濃縮的甜菜紅素液體經0.22 μm膜過濾后用于分析測定。UPLC條件：色譜柱為Poroshell 120 SB-C18柱（50 mm×2.1 mm，2.7 μm），柱溫為30 ℃；流動相：A相為體積分數0.1%甲酸溶液（加0.005 mol/L醋酸銨）；B相為甲醇；流速為0.5 mL/min。洗脫梯度為：0～5.0 min，0% B；5.0～12.0 min，0%～10% B；12.0～25.0 min，10%～90% B；25.0～35.0 min，90% B；35.0～36.0 min，90%～0% B；36.0～40.0 min，0% B。MS條件：全掃描模式；正離子模式；分辨率：70 000；誘導解離能量：0 eV；掃描范圍：m/z250～800；檢測離子：m/z551。

1.3.3 實驗動物分組及給藥

小鼠的給藥劑量由實驗室前期藥效學動物實驗得出的灌胃劑量確定。選用200 只健康的小鼠，體質量18～22 g。適應性飼養5 d后，隨機挑選40 只，每組10 只，用于抗氧化實驗；其余160 只用于免疫調節實驗。設置空白組（灌胃0.25 mL/10 g生理鹽水）；將噴霧干燥后的甜菜紅素干粉用生理鹽水溶解，配制甜菜紅素高（100 mg/kg）、中（50 mg/kg）、低（25 mg/kg）劑量組（以干物質計）用于灌胃小鼠。每天早晨9∶00灌胃，連續灌胃15 d。

1.3.4 抗氧化實驗

于末次灌胃2 h后進行眼眶采血，然后分離血清。各組小鼠血清中的GSH-Px、SOD活力及MDA濃度按試劑盒說明書方法測定。

1.3.5 免疫調節實驗

1.3.5.1 脾臟、胸腺指數及碳廓清能力的測定

末次灌胃2 h后，將稀釋4 倍體積的印度墨汁（10 mL/kg）從小鼠尾部靜脈注入，立即計時，分別在注入墨汁2 min和10 min時從小鼠內眥靜脈叢取血20 μL，并立即將其加入到2 mL質量分數0.1% Na2CO3溶液中。在600 nm波長處測定OD值，以Na2CO3溶液作為空白對照。接著將小鼠斷頸脫臼致死，小心解剖取動物肝臟、脾臟和胸腺，用濾紙吸干臟器表面血污，分別稱質量，計算胸腺和脾臟指數，按式（1）計算吞噬指數α以反映小鼠碳廓清能力。

1.3.5.2 小鼠脾淋巴細胞增殖能力的測定

末次灌胃2 h后，將各組小鼠用體積分數70%乙醇溶液消毒后，在無菌操作臺內無菌取小鼠脾臟，將脾臟置于裝有冷的無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）的無菌培養皿內，用1 mL無菌注射器吸取PBS，將針頭刺入脾臟內反復用PBS吹打，直至脾臟薄如蟬翼狀并發白后停止，得到的液體即為淋巴細胞懸液，用臺盼藍計數活細胞數后，再用含質量分數10%胎牛血清的RPMI-1640培養基調整細胞濃度為5×106個/mL，以1 mL/孔接種于24 孔板，同時用7.5 μg/mL ConA刺激（測試孔），以不加ConA作為非刺激孔（空白孔）。置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養68 h后，加入5 mg/mL MTT（50 μL/孔），繼續培養4 h后取出；加入二甲基亞砜溶液600 μL，振蕩數次后于室溫暗處放置15 min，用酶標儀在570 nm波長處測定吸光度，以測試孔與空白孔OD值的差值表示脾淋巴細胞增殖能力。

1.3.5.3 血清溶血素水平的測定

豚鼠補體制備：取5 只豚鼠，以無菌操作采集血液，采集好的血液置于4 ℃冰箱過夜，次日離心分離血清即可分離到補體。取5 mL豚鼠血清加入1 mL壓積綿羊紅細胞（sheep red blood cells，SRBC），水平放置于4 ℃冰箱內吸附30 min后離心取上清液，將上清液置于－20 ℃保存備用。

用半數溶血值（half hemolysis value，HC50）法測定各組小鼠的血清溶血素水平。末次灌胃2 h后，各組小鼠于腹腔注射質量分數2% SRBC懸液0.2 mL。正常飼喂4 d，然后采血并分離血清，將血清用無菌生理鹽水稀釋200 倍體積。取干凈試管，向其中依次加入稀釋后的血清1 mL、質量分數10% SRBC 0.5 mL和生理鹽水稀釋10 倍體積的補體1 mL，混合均勻，同時設定無血清管作為對照管，于37 ℃水浴30 min后，用冰水浴終止反應。離心，取1 mL上清液與3 mL都氏試劑混合均勻，同時取0.25 mL 10% SRBC懸液加都氏試劑至4 mL，充分混勻作為半數溶血管。放置10 min后，以對照管為空白，測定各樣品管在540 nm波長處的OD值，按式（2）計算HC50。

1.3.5.4 NK細胞活性的測定

實驗前將靶細胞K562進行細胞傳代培養，Hanks液洗滌2 次，計數，用RPMI1640完全培養液調整細胞濃度為2×105個/mL。末次灌胃2 h后，每組小鼠中選取5 只，按照1.3.5.2節方法制備效應細胞K592，調整細胞濃度為1.0×107個/mL后加入96 孔板，每孔100 μL。將靶細胞（效應細胞∶靶細胞＝50∶1）加入高、中、低劑量組實驗孔，每孔100 μL；自然釋放孔加入100 μL培養液；最大釋放孔加入100 μL質量分數2% NP40。37 ℃培養4 h，離心，取上清液100 μL置于96 孔酶標板中，加入LDH基質液100 μL，反應8 min，以30 μL 1 mol/L HCl溶液終止反應，用酶標儀于490 nm波長處測定OD值。自然殺傷（natural killer，NK）細胞活性按式（3）計算。

1.4 數據統計與分析

2 結果與分析

2.1 甜菜紅素UPLC-HRMS/MS分析結果

采用UPLC-HRMS/MS對甜菜汁進行全掃描后，提取m/z 551，在保留時間分別為9.38、11.17 min處檢測到2 個色譜峰（圖1）。保留時間為9.38 min時，對一級質譜準分子離子峰、碎片離子峰進行分析（圖2），結合文獻[11]對比，驗證其為甜菜紅苷（C24H26N2O13）。保留時間為11.17 min的化合物結構有待進一步研究。

圖1 甜菜紅素的離子色譜圖（m/z 551）Fig. 1 Ion chromatogram of betalain (m/z 551)

圖2 甜菜紅苷的質譜圖Fig. 2 Mass spectrum of betagin

2.2 甜菜紅素對小鼠血清GSH-Px、SOD活力及MDA濃度的影響

表1 甜菜紅素對小鼠血清GSH-Px、SOD活力及MDA濃度的影響Table 1 Effect of betalain on GSH-Px, SOD activity and MDA levels in serum of mice

從表1中可以看出，與空白組比較，甜菜紅素各劑量組均能提高小鼠血清中的GSH-Px活力，其中，中劑量組效果最顯著（P＜0.01），高、低劑量組效果相對較差（P＜0.05）。高、中、低劑量組與空白組相比SOD活力均顯著提高，其中，中劑量組效果較好。與空白組相比，高、中劑量組均能顯著降低小鼠血清中MDA濃度（P＜0.05），但低劑量組沒有顯著性影響。

2.3 甜菜紅素對小鼠免疫器官臟器指數及碳廓清能力的影響

表2 甜菜紅素對小鼠免疫器官臟器指數及吞噬指數的影響Table 2 Effects of betalain on spleen and thymus indices and macrophage phagocytosis index in mice

從表2可以看出，與空白組比較，甜菜紅素各劑量組均能提高小鼠胸腺指數，其中，中劑量組效果最好（P＜0.01），高、低劑量組效果相對較差（P＜0.05）；低劑量組小鼠脾臟指數無顯著變化，高、中劑量組均顯著提高（P＜0.05）；低劑量組吞噬指數無顯著變化，高、中劑量組均顯著提高（P＜0.05），且中劑量組效果更好。

2.4 甜菜紅素對小鼠脾淋巴細胞增殖、NK細胞活性、血清溶血素水平的影響

表3 甜菜紅素對小鼠脾淋巴細胞增殖能力、NK細胞活性、血清溶血素水平的影響Table 3 Effects of betalain on lymphocyte proliferation and NK cell activity as well as serum hemolysin in mice

從表3可以看出，與空白組比較，甜菜紅素各劑量組均能提高小鼠脾淋巴細胞增殖能力、NK細胞活性和血清溶血素水平，其中高、中劑量組效果顯著（P＜0.05），低劑量組雖然高于空白組，但差異不顯著。本研究結果說明高、中劑量甜菜紅素能增強小鼠抗體生成能力。

3 討 論

免疫是一種機體識別“自己”、“非己”并排除異己物質，從而維持機體內環境平衡的生理功能，具有維持自身穩定、免疫監視和免疫防御的重要作用。免疫系統包括固有免疫和適應性免疫，是人類對抗感染首要的防御系統。同時，它也是衡量人的健康和長壽的一個指標。然而，壓力、疲勞、化療和輻射會引起免疫抑制[12]。

同時，一些巨噬細胞和淋巴細胞增殖的有絲分裂活動與活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產生密切相關[13]。ROS的過度積累會對免疫細胞產生負面影響。比如，它們會通過氧化膜脂和加速GSH-Px的消耗影響細胞成分，最終導致氧化損傷和免疫抑制[14]。許多研究表明，天然食品中含有豐富的生物活性物質，能夠中和ROS，從而保護生物體免受氧化損傷，增強免疫功能。近年來，由于甜菜紅素具有藥理活性，已經引起了人們的更多關注。本研究在前期對甜菜紅素的提取及抗腫瘤作用研究[15-16]的基礎上，開展了甜菜紅素的體內抗氧化和免疫調節的研究。

適應性免疫包括體液和細胞免疫，主要為依賴T、B淋巴細胞的免疫活動。研究外來抗原免疫后的抗體反應是一種重要的免疫功能檢測方法[17]。利用SRBC免疫小鼠時，B淋巴細胞可以分泌產生溶血素，血清中溶血素的水平可以用來評價機體的體液免疫狀態。

T淋巴細胞的免疫功能活性可以通過其排除靶細胞、產生各種細胞因子以及增殖活動等指標反映，進而評價機體細胞免疫狀態。在本研究中，血清溶血素和利用ConA刺激的淋巴細胞增殖實驗可用于闡明甜菜紅素對適應性免疫的作用。實驗結果表明，與空白組比較，高、中劑量甜菜紅素能顯著增加血清溶血素水平（P＜0.05），并顯著增強小鼠的淋巴細胞增殖能力（P＜0.05）。給KM小鼠灌胃甜菜紅素后，小鼠的體液免疫和細胞免疫水平均明顯提高，其中中劑量組效果最明顯。

SBRC作為抗原刺激T、B淋巴細胞的反應，需要巨噬細胞和T、B淋巴細胞的共同作用。巨噬細胞表面有多種模式識別受體、細胞因子受體和調理性受體，具有直接殺傷胞內寄生菌、加工處理提呈抗原[18]、啟動適應性免疫應答以及自身分泌細胞因子發揮免疫調節等作用。因此，本實驗研究了甜菜紅素對KM小鼠碳廓清能力的影響，結果表明，中劑量甜菜紅素對小鼠吞噬能力的提高效果最好，高劑量組效果不及中劑量組，這種情況可能是因為巨噬細胞在將抗原加工和提呈給T、B淋巴細胞的過程中，甜菜紅素劑量增加可能會下調巨噬細胞的功能，進而影響其對抗原加工處理的作用。

胸腺和脾臟是淋巴細胞分化、成熟和定居的場所，高、中劑量甜菜紅素能顯著提高胸腺和脾臟指數，說明甜菜紅素通過影響免疫器官指數影響淋巴細胞的作用，推測甜菜紅素能夠提高小鼠適應性免疫功能。

除了適應性免疫功能以外，固有免疫功能在機體的免疫系統中同樣具有重要作用。NK細胞屬于固有免疫細胞，在固有免疫中扮演重要角色，NK細胞殺傷靶細胞時既不需要特異性抗體參與，又不需要抗原預先致敏淋巴細胞。NK細胞在抗腫瘤和抗感染免疫中發揮重要作用，其活性的控制是通過NK細胞表面受體的表達及靶細胞表面配體的呈現共同作用調節[19]。目前，K562細胞是常被用于評價NK細胞活性的靶細胞，本研究結果表明，與空白組比較，高、中劑量甜菜紅素能顯著提高NK細胞的活性（P＜0.05），說明甜菜紅素增加了NK細胞對靶細胞的殺傷活性，進一步說明甜菜紅素提高了小鼠的固有免疫水平。有研究表明，NK細胞不僅能夠識別、殺傷腫瘤細胞和病毒感染的細胞，同時能夠調節其他免疫細胞分泌趨化因子和細胞因子，比如干擾素-γ、腫瘤壞死因子-α等[20]。因此，今后可以利用雙抗夾心酶聯免疫吸附測定檢測甜菜紅素對這些細胞因子的作用，從而更全面地了解甜菜紅素對NK細胞活性的影響。

很多研究數據證明，氧化應激機制在降低免疫系統的生理功能中有促進作用[21]。免疫細胞和免疫器官對氧化應激十分敏感[22]，同樣地，免疫反應一般也會產生ROS，尤其是由中性粒細胞和巨噬細胞刺激產生的“呼吸性爆裂”更明顯。抗氧化劑在清除ROS中扮演了重要角色，其可以保護細胞免受氧化損傷和保持正常功能。抗氧化劑對體外和體內免疫功能的有益作用已經被證實。有研究報道，抗壞血酸的消耗能夠損害NK細胞的活性[23]。另有研究表明，N-乙酰半胱氨酸和VE能夠平衡免疫功能的改變[24]，這些研究均表明抗氧化作用與免疫作用密切相關。為了避免氧化應激，多種抗氧化防御機制可有效消除ROS，在導致大分子氧化之前，抗氧化酶是最有效的防御機制之一，能中和ROS的主要酶有SOD、GSH-Px和過氧化氫酶。MDA是脂質過氧化的分解產物，其濃度反映了細胞膜受損害的程度[25]。有研究表明，提高輻射小鼠腦組織、血液及肝臟中SOD和GSH-Px的活性、降低MDA的含量，可以達到抗輻射作用[26]。另有研究表明，通過降低由輻射、噪聲引起的MDA濃度升高，提高血清SOD、GSH-Px活性，可以使造血器官脾臟和免疫器官胸腺的臟器指數增加[12,27-28]。這些研究結果說明抗氧化能力的提高可能會提高免疫功能，進而提高機體對抗外界的應激能力。本研究結果表明，甜菜紅素能顯著提高KM小鼠血清中SOD、GSH-Px活力，并顯著降低血清中MDA濃度，說明甜菜紅素對免疫調節作用的影響可能與其抗氧化活性有關。

綜上，甜菜紅素能明顯起到免疫調節的作用，同時，其抗氧化活性有助于增強小鼠的免疫作用。因此，甜菜紅素能夠有效地改善人體的健康和免疫功能。本研究結合甜菜紅素抗氧化及免疫功能，為開發甜菜紅素作為保健品并推向臨床應用提供參考。