大豆分離蛋白-杏鮑菇多糖共價結合物對RAW264.7細胞的免疫調節作用

吳怡亮，仲 磊，馬 寧，裴 斐，馬高興，胡秋輝,*

（1.南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心，江蘇高校糧油質量安全控制及深加工重點實驗室，江蘇 南京 210023；2.南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

免疫調節與各種生理和病理狀況密切相關，如炎癥、癌癥和腫瘤的發生等[1]。作為人體內的一種重要防御，巨噬細胞釋放的免疫介質在抗原入侵時發揮重要作用[2]。當人體受到病理或機械損傷刺激時，激活的巨噬細胞吞噬能力增強，可以產生一氧化氮（NO）并分泌腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白細胞介素1β（interleukin 1β，IL-1β）和IL-6等一系列細胞因子抵御病原體入侵，從而保護宿主免受病原體的侵害[3-6]。因此，巨噬細胞激活是宿主提高免疫能力的重要機制。隨著人們健康意識的提高，膳食營養已經成為社會關注的焦點。作為傳統主食，谷物在我國膳食系統中占有重要地位。其中，谷物蛋白資源豐富、價格低廉，具有改善心血管疾病、降低膽固醇水平和減少癌癥發病率等生理功能，被廣泛用于食品工業中[7-8]。

大豆是中國最重要的谷物糧食之一，大豆中的蛋白質含量高達40%左右，并且氨基酸組成全面，是優質植物蛋白的重要來源[9]。大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI）是一種廉價、高營養的谷物蛋白，但較差的功能性質削弱了其生理活性[10-11]。杏鮑菇多糖（Pleurotus eryngii polysaccharide，PEP）是一種生物反應調節物，具有降血壓、降血脂、抗炎癥和抗腫瘤等生理功能[12-14]。此外，它能誘導巨噬細胞分泌細胞因子，增強細胞吞噬病原體的能力，從而實現機體免疫調節作用[15-17]。糖基化是一種基于美拉德反應的化學修飾方法，能使蛋白與糖類共價結合，從而改善蛋白質的功能性質和生物活性[18]。Jing等[19]利用美拉德反應制備了一種酪蛋白-葡萄糖共價結合物，與單一的酪蛋白或葡萄糖及兩者的混合物相比，這種結合物的還原能力和自由基清除活性更強，具有出色的抗氧化活性。張小沛等[20]發現五味子葉多糖與氨基酸共價結合物的抗氧化能力與糖基化反應時間在一定范圍內成正比。此外，研究表明，基于美拉德反應的蛋白-多糖共價結合物具有抑制腫瘤細胞增殖的作用[21]。在前期研究中，本課題組利用美拉德反應制備了一種大豆分離蛋白-杏鮑菇多糖共價結合物（soybean protein isolate-P. eryngii polysaccharide conjugate，W-PP），發現這種結合物具有較強的蛋白功能性質——乳化性、水溶性和熱穩定性。然而，關于W-PP的生物活性——免疫調節作用還未深入研究。

小鼠巨噬細胞系RAW264.7是體外研究功能成分免疫調節作用的理想模型，本實驗基于RAW264.7細胞，以脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）為陽性對照，SPI、PEP和大豆分離蛋白-杏鮑菇多糖混合物（mixture of soybean protein isolate and P. eryngii polysaccharide，PP）為樣品對照，研究W-PP對巨噬細胞的活力、中性紅吞噬活性、NO釋放量、細胞因子分泌及其mRNA表達的影響，進而評價這種共價結合物的免疫調節活性，以期為后續進一步的深入研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

低溫脫脂豆粕 西亞化工有限公司；杏鮑菇超微粉 江蘇芝慶堂生物科技有限公司；小鼠巨噬細胞系RAW264.7 上海瑞鹿生物科技有限公司復旦IBS細胞資源中心；RPMI1640 美國Gibco公司；0.25%胰蛋白酶、雙抗（青、鏈霉素）、胎牛血清、LPS、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、噻唑藍（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT）和1×磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS） 北京索萊寶公司；中性紅試劑盒、NO檢測試劑盒 上海碧云天生物技術有限公司；酶聯免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒（TNF-α、IL-6、IL-1β） 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

SpectraMax-190酶標儀 美國Biorad公司；T18高速分散機 德國IKA公司；J-50氣流粉碎機 意大利Tenologia Meccanica公司；Allegra 21R臺式高速冷凍離心機美國Beckman公司；TP600型梯度聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 日本Takara公司；Lightcycle K熒光定量PCR儀 杭州BIOER公司。

1.3 方法

1.3.1 SPI的提取

S P I制備工藝：低溫脫脂豆粕打粉，2 0 0 目過篩得到低溫脫脂豆粉。將豆粉和水按照1∶10（m/V）的比例溶解豆粕，用2 mol/L NaOH溶液調節pH值至8.0，常溫攪拌2 h，離心（10 000×g、20 min、4 ℃）得到上清液，用2 mol/L HCl溶液調節pH值至4.5。在4 ℃下5 000 ×g離心5 min得到質量分數5%～10%干物質，再用2 mol/L NaOH溶液調節pH值至7.0，4 ℃透析24 h，冷凍干燥后得到自制SPI。

1.3.2 PEP的提取

取杏鮑菇超微粉，按液料比10∶1～50∶1（V/m）加入蒸餾水，在60～100 ℃水浴加熱條件下浸提3 h。浸提液4 000 ×g離心20 min取上清液，然后采用Sevag試劑（V（三氯甲烷）：V（正丁醇）＝4∶1）法去上清液蛋白，離心（10 000×g、10 min）向上清液中加入4 倍體積無水乙醇，在4 ℃下沉淀過夜，4 500×g離心10 min取沉淀，冷凍干燥，得到樣品PEP。

將SPI和PEP按照質量比1∶1混合得到大豆分離蛋白-杏鮑菇多糖混合組（PP）。

1.3.3 濕熱法處理SPI和PEP

將前期制備好的SPI和PEP按照質量比1∶1混合并配成質量濃度為5 g/100 mL的溶液，磁力攪拌器混合均勻，在4 ℃下水化過夜。然后將樣品置于80 ℃水浴鍋中加熱3 h，并在4 ℃條件下10 000×g離心10 min。取上清液，冷凍干燥，獲得W-PP。于－20 ℃下貯存，待作進一步分析。

1.3.4 RAW264.7細胞培養

小鼠巨噬細胞系RAW264.7于RPMI1640完全培養液（含10%胎牛血清、100 U/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素）中生長，細胞培養瓶置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。當細胞鋪滿培養瓶底部80%時進行傳代，將培養至對數生長期的細胞用于后續實驗。

1.3.5 MTT法檢測細胞活力

采用MTT法[22]檢測細胞活性。將對數生長期的RAW264.7細胞按照約1×106個/mL的密度接種于96 孔板中，100 μL/孔，置于CO2培養箱培養至80%細胞貼壁后，吸去舊培養基，設置不接種細胞的空白組，對照組加入100 μL完全培養液，樣品組分別加入不同樣品溶液各100 μL。其中，樣品組包括不同質量濃度（0～400 μg/mL）的SPI、PEP、PP和W-PP溶液（以單純的RPMI1640為溶劑配制），每組設置6 個復孔，24 h后棄去上清液，每孔加入30 μL MTT（5 mg/mL）工作液，繼續培養4 h后棄去MTT工作液，每孔加入DMSO 100 μL，于搖床避光搖晃15 min，用酶標儀在570 nm波長處測定吸光度，實驗重復3 次。按照下式計算細胞活力。

式中：A0為空白組吸光度；A1為對照組吸光度；A2為樣品組吸光度。

1.3.6 中性紅法檢測細胞吞噬能力的測定

將RAW264.7細胞以1×106個/mL的密度接種于96 孔板中培養7 h，設置不含樣品的空白對照組（200 μL的RPMI1640完全培養液）、LPS組（1 μg/mL，200 μL），并基于1.3.5節的實驗結果設定細胞活力最佳的3 個質量濃度梯度（25、50、100 μg/mL，200 μL）的樣品組（SPI、PEP、PP和W-PP）。培養12 h后，按照中性紅試劑盒的操作方法，棄去上清液，每孔加入100 μL體積分數為0.075%中性紅溶液染色，繼續培養3 h棄去上清液，PBS洗滌3 次后每孔加入100 μL細胞裂解液，室溫搖床裂解10 min，在540 nm波長處測定吸光度。

1.3.7 NO釋放量的測定

取對數生長期的RAW264.7細胞，以1×106個/mL密度接種于96 孔板，每孔加100 μL細胞懸液，置于37 ℃恒溫培養箱內，待80%以上細胞貼壁后，吸去完全培養液并用PBS清洗3 次。空白對照組加入200 μL的RPMI1640完全培養液，陽性對照組加入200 μL LPS溶液（1 μg/mL），樣品組分別加入25、50、100 μg/mL的SPI、PEP、PP和W-PP溶液各200 μL，每組設6 個復孔，培養24 h后收集上清液，按照NO測定試劑盒的操作說明測定細胞NO釋放量。

1.3.8 TNF-α、1L-1β和IL-6濃度的測定

取對數生長期的RAW264.7細胞，以1×106個/mL的密度接種于96 孔細胞培養板，每孔加100 μL細胞懸液，按1.3.7節中的方法處理各組后培養24 h，收集上清液，參照IL-6、1L-1β和TNF-α的ELISA試劑盒說明書步驟檢測細胞上清液中各細胞因子的濃度。

1.3.9 TNF-α、1L-1β和IL-6的mRNA水平測定

取對數生長期的RAW264.7細胞，調整細胞懸液濃度為1×106個/mL，接種于6 孔板，每孔2 mL細胞懸液，置于37 ℃恒溫培養箱內，待80%以上細胞貼壁后，吸去完全培養液并用PBS清洗3 次。空白對照組加入2 mL的RPMI1640完全培養液，LPS組加入2 mL LPS溶液（1 μg/mL），樣品組分別加入2 mL 25、50、100 μg/mL的PEP和W-PP。細胞培養箱內培養24 h后，棄去上清液，用PBS洗滌細胞沉淀1 遍，收集細胞提取RNA。采用實時熒光PCR法測定細胞中TNF-α、1L-1β和IL-6的mRNA水平。具體操作步驟如下[23-24]。1）組織勻漿：向各樣品中加入1 mL的TRIzol試劑，用移液器反復吹打；2）將上述勻漿液室溫放置5 min，待核酸和蛋白充分解離。向勻漿液中加入0.2 mL氯仿，蓋緊管蓋，手動劇烈振搖15 s，然后室溫靜置2～3 min；3）4 ℃、10 000×g離心10 min；4）小心吸取上層水相（無色）加入到新試管中，同時記錄所吸取的水相體積；5）加入所吸取水相等體積預冷的異丙醇，蓋緊管蓋，輕輕搖勻；6）室溫靜置10 min，待RNA充分沉淀；7）4 ℃、10 000×g離心10 min；8）將上清液棄除，保留沉淀，每管加入1 mL體積分數為75%乙醇溶液潤洗，蓋緊管蓋，輕輕晃動離心管，以去除殘留的異丙醇和鹽分。4 ℃、7 500×g離心5 min；9）將上清液棄除，打開管蓋，將RNA沉淀干燥（室溫揮發或真空干燥）。注意RNA沉淀不可完全干燥，否則難以溶解；10）將RNA沉淀溶解于適量的無RNase水中。采用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，并用GelStain染色。

1.4 數據處理

使用SPSS 18.5軟件進行單因素方差分析，實驗結果用平均值±標準差表示，且P＜0.05表示數據有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 W-PP對RAW264.7細胞活力的影響

圖1 SPI、PEP、PP和W-PP對RAW264.7細胞活力的影響Fig. 1 Effects of SPI, PEP, PP and W-PP on cell viability in RAW 264.7 cells

如圖1所示，與空白對照組相比，不同樣品對RAW264.7細胞的活力產生一定影響。當質量濃度為2～50 μg/mL時，SPI、PEP、PP和W-PP 4 種樣品對細胞活力均無顯著影響（P＞0.05），表明4 種樣品質量濃度在2～50 μg/mL時對細胞沒有毒性。SPI、PEP、PP質量濃度為100～400 μg/mL，W-PP質量濃度為200～4 0 0 μ g/m L時，細胞活力呈顯著降低的趨勢（P＜0.05），表明過高質量濃度的樣品對細胞毒性較大，從而降低其活力[25]。因此，綜合細胞活力實驗結果，選擇25、50 μg/mL和100 μg/mL這3 個質量濃度梯度對細胞進行后續實驗處理，并在此質量濃度下，評價W-PP對RAW264.7細胞的免疫調節作用。

2.2 W-PP對RAW264.7細胞中性紅吞噬活性的影響

圖2 SPI、PEP、PP和W-PP對RAW264.7細胞中性紅吞噬活性的影響Fig. 2 Effects of SPI, PEP, PP and W-PP on phagocytic activity in RAW264.7 cells

中性紅法可以用來評價RAW264.7細胞的吞噬功能[26]。如圖2所示，LPS組作為陽性對照，經LPS刺激后，RAW264.7細胞中性紅吞噬能力顯著加強（P＜0.05）。隨著質量濃度的上升，SPI對RAW264.7細胞的中性紅吞噬能力無顯著影響，PEP、PP的中性紅吞噬活性在質量濃度為50、100 μg/mL時分別達到最大值。而W-PP對細胞中性紅吞噬活性呈顯著促進作用（P＜0.05），在100 μg/mL質量濃度時中性紅吞噬活性達到空白對照組的2.05 倍，說明糖基化SPI可以增強巨噬細胞對外來物質的吞噬作用，從而保護機體免受病原體侵蝕，提高機體免疫力。

2.3 W-PP對RAW264.7細胞NO濃度的影響

圖3 SPI、PEP、PP、W-PP對RAW264.7細胞NO濃度的影響Fig. 3 Effects of SPI, PEP, PP and W-PP on the production of nitric oxide in RAW 264.7 cells

研究表明，巨噬細胞被激活后生成NO，并與超氧陰離子自由基反應形成過氧亞硝基陰離子，協助機體對抗外來抗原，實現免疫調節作用[27-28]。如圖3所示，與空白對照組相比，RAW264.7細胞經LPS刺激后NO分泌量顯著增加（P＜0.05）。與空白對照組相比，SPI和PEP處理后細胞NO釋放量無顯著差異（P＞0.05）。而當PP、W-PP在質量濃度為50 μg/mL和100 μg/mL時，NO釋放量隨著質量濃度的升高而上升，并且都在100 μg/mL時達到最大值，說明PP、W-PP樣品在一定質量濃度下可激活并提高巨噬細胞RAW264.7分泌NO的能力。

2.4 W-PP對RAW264.7細胞TNF-α、IL-1β和IL-6質量濃度及其mRNA表達水平的影響

圖4 SPI、PEP、PP、W-PP對RAW264.7細胞TNF-α（A）、IL-1β（B）和IL-6（C）分泌量的影響Fig. 4 Effects of SPI, PEP, PP and W-PP on the secretion of TNF-α (A),IL-1β (B) and IL-6 (C) in RAW 264.7 cells

RAW264.7細胞總RNA提取電泳結果如圖5所示。LPS、PEP、W-PP各組RNA條帶清晰，表明成功提取RNA。

圖5 RAW264.7細胞總RNA提取電泳圖Fig. 5 Electropherogram of total RNA extracts from RAW264.7 cells

圖6 PEP和W-PP對RAW264.7細胞TNF-α（A）、IL-1β（B）和IL-6（C） mRNA相對表達量的影響Fig. 6 Effects of PEP and W-PP on gene expression of TNF-α (A),IL-1β (B) and IL-6 (C) in RAW 264.7 cells

巨噬細胞受到刺激后會產生細胞因子，它是一類具有調控免疫系統、細胞生長和損傷組織修復等功能的小分子可溶性蛋白[29-31]。巨噬細胞被激活后可以分泌白細胞介素和腫瘤壞死因子傳導并調控免疫通路[32]。如圖4所示，與空白對照組相比，LPS組的TNF-α、IL-1β和IL-6質量濃度顯著上升。與空白對照組相比，SPI和PP對細胞因子分泌量沒有顯著影響（P＞0.05），而PEP在較高質量濃度下對TNF-α（＞50 μg/mL）和IL-1β、IL-6（＞100 μg/mL）的質量濃度具有顯著促進作用。PEP組的TNF-α、IL-1β和IL-6質量濃度較PP組更高，說明在高質量濃度下PEP對細胞因子的分泌有促進作用。W-PP對RAW264.7細胞因子分泌具有較強的促進作用且存在劑量依賴效應，質量濃度為100 μg/mL時表現出最佳的免疫調節活性（P＜0.05）。此外，與空白對照組相比，在一定質量濃度下PEP和W-PP均能顯著提高IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA相對表達量，且存在劑量依賴效應（圖6），其中共價結合物上調細胞因子表達的能力最強。

在非炎癥巨噬細胞模型中，細胞因子的分泌水平可以作為評估免疫激活和調節能力的指標[33]。其中，白細胞介素（IL-1β和IL-6）和TNF-α能夠輔助機體清除外源性抗原和異常細胞，并與T細胞協同作用，調節機體免疫應答[34-35]。與W-PP相比，單一的SPI及其與PEP的混合物在培養液中的溶解度較低，導致它們在細胞中的轉運吸收效率下降，影響其免疫調節作用。此外，美拉德反應引入的PEP穩定了SPI的空間結構，糖鏈的引入提高了SPI的溶解性和抗氧化活性，從而增強巨噬細胞的免疫調節作用[36-38]。由此可知，W-PP能通過提高RAW264.7細胞的IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌量及其mRNA表達水平來實現免疫調節作用。

3 結 論

本實驗研究了W-PP對RAW264.7細胞活力、中性紅吞噬活性、NO釋放量、細胞因子分泌及其mRNA表達水平的影響。結果表明，W-PP在25～100 μg/mL范圍變化時，能顯著增強RAW264.7細胞中性紅吞噬能力、NO釋放量和細胞因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）質量濃度。此外，PEP和W-PP能顯著提高這3 種細胞因子的mRNA水平，其中100 μg/mL W-PP對細胞因子mRNA水平的上調作用最強。由此可得，W-PP具有較強的免疫調節作用，說明糖基化反應可以增強SPI的生物活性。